Deel dit artikel

vele technologische ontdekkingen doen er lang over om voet aan de grond te krijgen en de wetenschap een beetje te beïnvloeden. Het crispr/cas9-systeem is echter één van de ontdekkingen die het landschap van genetische manipulatie drastisch en met rasse schreden aan het veranderen is. door specifiek in te grijpen in het dna zelf zou de techniek kunnen worden ingezet in de strijd tegen kanker en aangeboren chronische ziektes.

CRISPR/Cas9, de geknipte oplossing voor genetische manipulatie

Philip Roelandt

DNA is de moleculaire code waarin onze erfelijke informatie vervat zit. Ons DNA bestaat uit twee complementaire strengen waarop alle informatie staat die nodig is om de cellen van ons lichaam te laten functioneren en samenwerken. Elke streng bestaat uit een ellenlange combinatie van slechts vier moleculen namelijk adenine (A), cytosine (C), guanine (G) en thymine (T). Zoals gezegd zijn beide strengen complementair: waar een A staat op de ene streng, staat een T op de andere streng en omgekeerd. Hetzelfde koppelpatroon geldt ook voor C en G. Wanneer een cel deelt, worden de twee strengen DNA volledig uiteengerafeld, over beide dochtercellen verdeeld en moeten ze weer worden aangevuld tot dubbelstrengig DNA. Daarbij treden dagelijks willekeurig miljoenen foutjes op in één van de strengen DNA, die gelukkig vlot worden hersteld voor er zich problemen voordoen doordat er nog steeds een complementaire streng aanwezig is die als model dient. (De Nobelprijs voor Chemie 2015 werd toegekend aan drie onderzoekers voor hun onderzoek naar DNA-herstel). Op het moment dat er in een cel eiwitten moeten worden aangemaakt, wordt het DNA op specifieke plaatsen wat losser en worden korte enkelvoudige strengetjes (zogenaamd RNA) gevormd die op hun beurt een waterval van processen in gang zetten. RNA-strengetjes zijn als het ware ‘berichten’ van het DNA aan de rest van de cel.

Het CRISPR/Cas-systeem zorgt ervoor dat het vreemde virus-RNA of -DNA gedetecteerd en stuk geknipt wordt voor het verdere schade kan aanrichten

CRISPR staat voor ‘Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats’. De CRISPRs zijn specifieke stukjes repetitief DNA, waarin dezelfde DNA-moleculen steeds herhaald worden. De eerste CRISPR-plek in het DNA werd per toeval in 1987 ontdekt in bacteriën van de Escherichia coli en werd sindsdien in quasi alle cellen teruggevonden. Samen met de CRISPR-geassocieerde (Cas)eiwitten spelen deze stukjes DNA een rol in (antivirale) immuniteit. Wanneer virussen cellen of bacteriën infecteren, verspreiden ze hun DNA of RNA in de gastheercel en gebruiken de machinerie van hun gastheer om hun eigen eiwitten aan te maken. Het CRISPR/Cas-systeem zorgt er nu voor dat het vreemde virus-RNA of -DNA gedetecteerd en stuk geknipt wordt voor het verdere schade kan aanrichten. Beetje bij beetje werden de functies van de verschillende sequenties en Cas-eiwitten achterhaald. Zo werd in 2011 ontdekt dat een van de Cas-eiwitten, namelijk Cas9, in staat is beide strengen van het DNA tegelijkertijd te knippen. Slechts twee jaar later werd aangetoond dat de combinatie van CRISPR en Cas9 kon worden gebruikt om ons genetisch materiaal te manipuleren en nog eens twee jaar later is het gebruik van CRIPSR/Cas9 bijna schering en inslag.

Waarom wil men DNA knippen, als het toch zo snel herstelt? Als er geen korte enkelstrengige ‘vervangstukken’ RNA in de buurt beschikbaar zijn, worden de eindjes DNA gewoon terug aan elkaar geplakt door specifieke eiwitten (het zogenaamde non-homologous end joining). Deze snelle noodoplossing is echter heel gevoelig voor foute herstellingen (ontbrekende stukken, verkeerde koppeling van A-T/C-G, …), zeker wanneer beide DNA-strengen tegelijk doorgeknipt worden zoals bij CRISPR/Cas het geval is. Er is dan namelijk geen complementaire ‘gietvorm’ beschikbaar om de ene geknipte streng aan te spiegelen en foutloos opnieuw aan te plakken. Als er daarentegen wél bruikbare compatibele stukken RNA in de cel aanwezig zijn, worden die stukken gebruikt om de breuk te dichten (de zogenaamde homologe recombinatie). Het gevolg hiervan is dat er nieuwe stukken RNA (variërend van één letter tot grote sequenties) in ons DNA geïntegreerd worden, waardoor de functies van de genen in die DNA-regio kunnen veranderen. Die veranderingen kunnen zowel voordelig als nadelig zijn voor de cel of het organisme dat deze verandering draagt. Voordelig zou bijvoorbeeld zijn dat de cel of het organisme extra kansen op overleving verwerft, dat is de basis van de evolutietheorie. Nadelig zou zijn dat er door de verworven verandering nieuwe ziekten, zoals kanker, zouden ontstaan. Het systeem waarbij er nieuwe stukken erfelijke informatie in het DNA geïntegreerd worden – homologe recombinatie – wordt gebruikt tijdens genetische manipulatie van cellen.

Je kunt een ziekte corrigeren door de fout uit het DNA te knippen en te vervangen door een normaal stuk

Genetische manipulatie door middel van homologe recombinatie is een aantrekkelijke techniek in het laboratorium. Je bepaalt zelf waar exact in het DNA je veranderingen aanbrengt: zo kunnen ziektes worden nagebootst door een bepaalde fout aan te brengen in een reeds gekend stuk DNA (een gen), of omgekeerd, je kunt een ziekte corrigeren door de fout eruit te knippen en te vervangen door een normaal stuk DNA. Als de functie van een bepaald gen nog niet gekend is, kun je het volledige gen verwijderen of een extra kopie toevoegen om zo de relevantie van dit gen te bestuderen. Ten slotte kun je de cellen zelfs een kleurtje geven: er bestaan immers kunstmatig gecreëerde A/T/G/C-combinaties die ervoor zorgen dat de cellen bijvoorbeeld een groen of rood fluorescerend eiwit gaan produceren. Hierdoor kunnen cellen die van het ene proefdier in een ander proefdier worden getransplanteerd na verloop van tijd teruggevonden worden.

Tot voor kort gebeurde homologe recombinatie door technieken die alleen gebruikmaakten van eiwitten zoals zinc finger nucleases (ZFN) en transcription activator-like effector nucleases (TALEN). Beide eiwitten herkennen een specifieke sequentie in slechts één van de strengen van het DNA. Je hebt dus twee verschillende ZFN/TALEN nodig om allebei de strengen van het DNA tegelijkertijd te knippen. Maar voor elk experiment moeten er volledig nieuwe ZNF/TALEN-eiwitten worden ontwikkeld, waardoor deze systemen niet voor alle genen van toepassing zijn.

Het innovatieve aan CRISPR/Cas9 is dat de techniek gebruikmaakt van stukjes RNA om bepaalde sequenties in het DNA te herkennen in plaats van telkens nieuwe eiwitten, zoals bij ZFN en TALEN. Specifieke sequenties RNA zijn veel eenvoudiger en sneller te maken dan eiwitten, en bovendien kunnen dankzij CRISPR/Cas9 quasi alle genen gericht worden gemanipuleerd. Je brengt dus je eigen ontworpen RNA-gids in de cel, die bindt spontaan aan het DNA op de plaats die je wou bereiken (want het RNA is zo ontwikkeld dat het er complementair aan is) waarna het Cas9-eiwit naar die zone in het DNA gegidst wordt om beide strengen te knippen. Ook als je verschillende genen tegelijkertijd wil knippen, voeg je eenvoudigweg verschillende gids-RNA’s toe en Cas9 doet de rest. Zo werden reeds volledige bibliotheken van gids-RNA’s in cellen ingebracht om nieuwe cruciale sequenties (en dus nieuwe genen, functies en pathways) te identificeren.

Elke medaille heeft natuurlijk ook een keerzijde. De kans is immers reëel dat het gids-RNA ergens anders in het DNA gaat binden en dus het Cas9-eiwit naar de verkeerde knipplaats stuurt met potentieel nadelige gevolgen. Het exacte risico is (nog) niet gekend maar er zijn reeds oplossingen gesuggereerd. Een van die oplossingen is het toevoegen van bijna identieke gids-RNA’s die geen Cas9 aantrekken, waardoor het aantal ‘off-target’-effecten afneemt zonder de efficiëntie van de echte gids-RNA-Cas9 te beïnvloeden. Uiteraard moeten deze ongewenste ‘off-target’-effecten volledig onder controle zijn vooraleer die techniek op patiënten wordt toegepast.

Wie dacht dat dit al complex was, stopt nu beter met lezen. Wetenschappers hebben immers ook wijzigingen kunnen aanbrengen in het Cas9-eiwit zelf waardoor het wel nog bindt aan het DNA maar niet meer knipt (de zogenaamde catalytically dead Cas, dCas9). Wat is nu het nut van een kapotte schaar? Na binding aan het DNA zit dCas9 letterlijk in de weg van andere eiwitten waardoor het gebonden gen functioneel is uitgeschakeld zonder dat het daarvoor geknipt moet worden. Deze techniek heet transcriptionele repressie of CRISPRi en laat toe de functie van gen te bestuderen door het uit te schakelen. Een laatste (r)evolutie in de complexiteit is het omgekeerde van de vorige toepassing: de binding van dCas9 aan een eiwit dat genen kan activeren (transcriptionele activatie of CRISPRa). Met deze techniek kunnen ‘slapende’ genen opnieuw worden geactiveerd. Door die nieuwste aanpassingen in de CRISPR/Cas-technieken, beschikken we nu dus ook over technieken die toelaten om specifieke genen aan en uit te zetten, bijna alsof je een lichtschakelaar bedient.

Aangeboren chronische ziekten, zoals mucoviscidose en hemofilie, zouden kunnen worden genezen door de aangeboren fouten in het DNA heel specifiek in de lichaamscellen te corrigeren

Als deze technieken binnen afzienbare tijd perfect op punt staan en kunnen worden toegepast op patiënten, betekent dit wellicht een copernicaanse revolutie binnen de geneeskunde. Aangeboren chronische ziekten, zoals mucoviscidose en hemofilie, zouden kunnen worden genezen door de aangeboren fouten in het DNA heel specifiek in de lichaamscellen te corrigeren, in plaats van te proberen de gevolgen van die fouten te herstellen met vaak dure medicijnen. (Herinner u patiëntje Victor en de strijd voor Soliris met toenmalig minister Onkelinx). In plaats van kanker te bestrijden met algemene chemotherapie die ook schadelijk is voor de gezonde cellen in je lichaam, zouden de fouten in de genen die verantwoordelijk zijn voor het ontstaan van de kanker gewoonweg kunnen worden afgeschakeld waardoor de tumoren stoppen met groeien. Of het ooit zo ver komt en of die genetische techniek een hoorn des overvloeds of een doos van Pandora is, zal de toekomst moeten uitwijzen.

Alleszins, anno 2015 is CRISPR-Cas9 aan zo’n wereldwijde veroveringstocht bezig dat de techniek binnen de kortste keren de standaardtechniek voor homologe recombinatie zal vormen in het laboratorium. Terwijl de research papers momenteel nog volop aandacht besteden aan het beschrijven en ontwikkelen van nieuwe CRISPR-Cas9-systemen, zal binnen een paar jaar de techniek allicht volledig ingeburgerd zijn.

Saul Sternberg en Jennifer Doudna, ‘Expanding the Biologist’s Toolkit with CRISPR-Cas9’, in: Molecular Cell, 2015, 58(4), 568-74.
Orphir Shalem, Neville E. Sanjana en Feng Zhang, ‘High-throughput functional genomics using CRISPR-Cas9’, in: Nature Review Genetics, 2015, 16(5), 299-311.

Philip Roelandt is als gastro-enteroloog verbonden aan de UZ Leuven en de KU Leuven.

Deel dit artikel

Gerelateerde artikelen