Deel dit artikel

de functie van een proteïne hangt in sterke mate af van zijn driedimensionale vorm. om de structuur van proteïnen te bestuderen gebruikt men X-stralenkristallografie. bij membraaneiwitten leidt de techniek echter tot een minder gedetailleerd beeld, omdat de moleculen in de kristallen van deze eiwitten niet optimaal geordend zijn. recent werd belangrijke vooruitgang geboekt in de structuurbepaling van verschillende receptoren.

Momentopnames van macromoleculen in beweging

Chris Ulens

Proteïnen of eiwitten zijn een klasse van biologische macromoleculen, die opgebouwd zijn uit polymere ketens van aminozuren. Proteïnen zijn essentiële bouwstenen in alle levende organismen, met heel diverse functies. Zo zijn er proteïnen die chemische omzettingen katalyseren, de zogenaamde enzymen. Deze enzymen vervullen een belangrijke rol bij de stofwisseling in ons lichaam, zoals de omzetting van voedingsstoffen in energie. Een bijzondere klasse van proteïnen vinden we in de vetrijke membraan die de levende cel omgeeft. Voorbeelden van die membraaneiwitten zijn ionenkanalen en -pompen, die zorgen voor het transport van ionen doorheen de membraan. Welke functie een proteïne nu vervult, hangt in sterke mate af van zijn driedimensionale vorm. Om de structuur van proteïnen te bestuderen wordt gebruikgemaakt van X-stralenkristallografie. Die techniek stelt ons in staat om de structuur van proteïnen op te helderen tot in het allerkleinste atomaire detail. Het driedimensionale beeld wordt verkregen aan de hand van eiwitkristallen die met X-stralen worden belicht. In deze kristallen bevinden zich miljoenen proteïnemoleculen, die op een ordelijke manier zijn gerangschikt zodat hun gezamenlijke verstrooiing van de X-stralenbundel een detecteerbaar signaal oplevert voor een fotogevoelige plaat of een CCD-camera (of ‘charge-coupled device’).

Die techniek is niet nieuw: ze werd reeds gebruikt door Sir John Kendrew en Max Perutz om de eerste structuren van proteïnen op te helderen, namelijk myoglobine en hemoglobine. Hiervoor werden ze beloond met de Nobelprijs voor de Scheikunde in 1962. In datzelfde jaar werd de Nobelprijs voor de Geneeskunde uitgereikt aan James Watson, Sir Francis Crick en Maurice Wilkins voor hun ontdekking van de dubbele-helixstructuur van DNA (desoxyribonucleïnezuur). Beide studies gaven voor de eerste keer een heel duidelijk inzicht in de functie van macromoleculen aan de hand van de kennis van hun driedimensionale structuur. Voor het eiwit hemoglobine begreep men hoe zuurstofmoleculen worden opgenomen en getransporteerd in het bloed. De dubbele-helixstructuur van DNA verschafte kennis over onze genetische code, het mechanisme van de celdeling, en legde op die manier de grondslagen voor de moderne genetica en de moleculaire biologie.

Vandaag, vijftig jaar later, zijn driedimensionale structuren bekend van bijna 80 000 verschillende biologische macromoleculen. Vooruitgang in de biotechnologie en de verbetering van hoogenergetische X-stralenbundels die worden opgewekt in deeltjesversnellers, hebben ons toegelaten om structuren op te helderen van moeilijk te isoleren proteïnen of eiwitkristallen met suboptimale eigenschappen. Het bekomen van eiwitkristallen is immers een absolute vereiste om een nauwkeurige driedimensionale structuur te bepalen met X-stralenkristallografie. Wanneer de miljoenen eiwitmoleculen niet op een optimale manier zijn geordend in het kristal, leidt dit tot een zwakkere verstrooiing van de X-stralenbundel en bijgevolg tot een minder gedetailleerd beeld. Dit is bijvoorbeeld het geval bij kristallen van membraaneiwitten.

Hierdoor bestaat er een grote lacune in onze kennis van de structuur van membraaneiwitten. Die eiwitten bevinden zich in de vetrijke membraan rondom elke levende cel en zijn essentieel voor de communicatie met de omgeving. Zo is de celmembraan voorzien van proteïnen die kleine poriën vormen, en zo de aan- en afvoer toelaten van water of afvalstoffen. Je kunt het vergelijken met het sanitaire systeem van een woning. Er zijn ook membraaneiwitten, de zogenaamde ionenkanalen, die instaan voor geleiding van elektriciteit. Dit is een belangrijk proces in het centrale zenuwstelsel. Tot slot bevinden zich in de celmembraan ook gespecialiseerde sensoren voor chemische substanties, zoals hormonen en neurotransmitters, die de huishouding van ons organisme regelen.

Tot voor kort was er weinig gekend over de driedimensionale structuur van deze proteïnen. De reden daarvoor is dat membraaneiwitten liever in een vetrijke omgeving vertoeven, terwijl kristallen veel makkelijker kunnen groeien in de omgeving van water. Om membraaneiwitten toch te laten kristalliseren, wordt er gebruikgemaakt van detergenten of zepen. Dit zijn moleculen die bestaan uit een lipofiele (vetzoekende) staart en hydrofiele (waterzoekende) hoofdgroep. Het lipofiele gedeelte zal zich richten naar de membraanproteïne, terwijl de hydrofiele kop ervoor zal zorgen dat het complex in de waterige oplossing blijft. Het proces waarbij membraaneiwitten uit hun vetrijke omgeving worden geëxtraheerd met detergenten is een zeer kritische stap bij het onderzoek, omdat vele membraaneiwitten dit niet tolereren en hierdoor hun structuur verliezen.

Membraaneiwitten vertoeven liever in een vetrijke omgeving, terwijl kristallen veel makkelijker kunnen groeien in de omgeving van water

De menselijke celmembraan huisvest ongeveer 7 000 membraaneiwitten, maar tot voor kort was van slechts twaalf types de driedimensionale structuur bekend. Recent werd een belangrijke vooruitgang geboekt in de structuurbepaling van verschillende receptoren gekoppeld aan G-proteïnes (GPCRs). Met 800 verschillende soorten vertegenwoordigen die receptoren de grootste familie van membraaneiwitten. Ze vervullen een cruciale rol in de signaaloverdracht van geur, licht, neurotransmitters en hormonen. Ze vormen ook het doelwit van vaak gebruikte geneesmiddelen zoals bloeddrukverlagende bètablokkers en antiallergische medicatie. De eerste belangrijke doorbraak in de structuurbepaling van deze receptoren kwam er in 2007. Toen slaagde een team, geleid door Brian Kobilka aan de Universiteit van Stanford, erin om de driedimensionale structuur op te helderen van de ß2-adrenerge receptor. Deze receptor functioneert als een chemische sensor voor adrenaline en is verantwoordelijk voor het versnellen van het hartritme bij fysieke inspanning of psychische stress. De receptor vertaalt als het ware het signaal van adrenaline in een kettingreactie van chemische veranderingen binnenin de cel, die via G-proteïnes uiteindelijk leiden tot een versnelling van het hartritme. Tijdens het proces van binding van adrenaline ondergaat de receptor een belangrijke structurele verandering, te vergelijken met de eerste dominosteen die omvalt in de reeks van gebeurtenissen die daarop volgen. Deze structuurverandering van een receptor in rusttoestand naar een geactiveerde toestand tijdens binding van chemische signaalmoleculen is een eigenschap die alle GPCRs met elkaar gemeen hebben.

De verdienste van het team van Kobilka is dat ze een antilichaam gericht tegen flexibele onderdelen van de receptor gebruikten om die te fixeren in de rusttoestand

De verdienste van het team van Kobilka is dat ze een antilichaam gericht tegen flexibele onderdelen van de receptor gebruikten om de ß2-adrenerge receptor te fixeren in de rusttoestand. Op die manier slaagden ze erin om kristallen te produceren waaruit structurele informatie op atomair niveau kon worden verkregen. Je kunt het vergelijken met spelende kinderen die door een handige fotograaf tot stilstand worden gebracht zodat een heldere en gedetailleerde foto kan worden genomen. De verkregen driedimensionale structuur toont dat de receptor is opgebouwd uit zeven transmembranaire helices, die met elkaar verbonden zijn door lussen. De helices vormen een bundel met bovenaan een trechtervormige bindingsplaats voor adrenaline of bloeddrukverlagende bètablokkers. Dankzij de hoge resolutie van die momentopname zijn de interacties tussen chemische transmitter en receptor zichtbaar tot in het allerkleinste atomaire detail. Van deze informatie wordt nu dankbaar gebruikgemaakt in de farmaceutische industrie, waar onderzoekers proberen om nieuwe geneesmiddelen te ontwikkelen die selectiever en beter binden op de bindingsplaats van de receptor. Dit is vergelijkbaar met het werk van een slotenmaker, die door passen en bijschaven een unieke sleutel probeert te ontwerpen voor een slot.

Dankzij de hoge resolutie van die momentopname zijn de interacties tussen chemische transmitter en receptor zichtbaar tot in het allerkleinste atomaire detail

Uiteraard stelt de driedimensionale structuur van de ß2-adrenerge receptor in rusttoestand slechts een momentopname voor van een receptor die zich uiterst dynamisch gedraagt. Om een beter inzicht te krijgen in de structurele veranderingen tijdens de activatie van de receptor bepaalden Kobilka en zijn collega’s een tweede momentopname van een geactiveerde toestand. Om dit te verwezenlijken, gebruikten ze een antilichaamfragment dat werd ontwikkeld door het team van Jan Steyaert aan het Vlaams Instituut voor Biotechnologie (VIB). Dit fragment stabiliseert de ß2-adrenerge receptor in de geactiveerde toestand. Een vergelijking van beide momentopnames, in rust en in actieve toestand, geeft een zeer gedetailleerd inzicht in de manier waarop de receptor binding van adrenaline vertaalt in een beweging die een kettingreactie start, die dan uiteindelijk leidt tot versnelling van het hartritme.

De voornaamste bewegingen van de receptor zijn zichtbaar op het punt waar de receptor contact maakt met G-proteïnes binnen de cel. De zesde transmembranaire helix ondergaat een zuidwaartse beweging van 1 nanometer. Bovendien verandert de conformatie van een intracellulaire lus die de derde en vierde transmembranaire lus met elkaar verbindt naar een helicale structuur. Tot slot is activatie van de receptor geassocieerd met het verbreken van het zogenaamde ‘ionische slot’. Dit slot wordt gevormd door een interactie tussen geladen aminozuurzijketens van een motief dat voorkomt in vrijwel alle GPCRs, namelijk aspartaat-arginine-tyrosine. In de geactiveerde toestand van de receptor wordt de interactie tussen het negatief geladen aspartaat aminozuur en het positief geladen arginine aminozuur verbroken. Samen met de conformationele veranderingen vormt het verbreken van het ionische slot een essentiële schakel in de transitie van de rusttoestand naar de geactiveerde toestand van de ß2-adrenerge receptor.

Naast het gebruik van antilichamen waren verschillende technologische ontwikkelingen essentieel in de doorbraak van Kobilka en zijn collega’s. Eén daarvan was de ontwikkeling van eiwitkristallisatie in zogenaamde lipide-kubische fase. Dit is een fasetoestand tussen de waterlaag en de lipidenlaag van de celmembraan. Deze lipide-kubische fase heeft een consistentie die lijkt op tandpasta, en vormt een gunstige omgeving om membraanproteïnen te laten kristalliseren. Hoewel de lipide-kubische fase artificieel is, bootst ze de omgeving van de celmembraan op betrouwbare wijze na, waardoor eiwitkristallen kunnen worden gecreëerd die bruikbaar zijn in diffractie-experimenten. Deze kristallen zijn echter kleiner dan 10 micrometer, wat de ontwikkeling noodzakelijk maakte van zogenaamde microfocus lichtbundels. In deeltjesversnellers, zoals de European Synchrotron Radiation Facility (ESRF) in Grenoble en de Swiss Light Source (SLS) nabij Zürich, worden elektronen versneld bij snelheden in de buurt van de lichtsnelheid, in een cirkelvormige baan met een omtrek van bijna een kilometer. De X-stralen die elektronen onder deze omstandigheden uitstralen worden vervolgens verzameld in een bundel van tientallen meters lang. Met behulp van spiegels wordt die bundel dan gefocusseerd tot een hoogenergetische lichtstraal met een doorsnede van 1 micrometer, wat toelaat om eiwitkristallen met grote precisie te belichten.

De opheldering van de driedimensionale structuren van de ß2-adrenerge receptor in rust en geactiveerde toestand is een belangrijke wetenschappelijke doorbraak. Intussen zijn structuren blootgelegd van andere types van GPCRs, zoals de adenosinereceptor, die het doelwit vormt van cafeïne, de histaminereceptor die het doelwit vormt van antiallergische geneesmiddelen, de dopaminereceptor, die het doelwit vormt van antipsychotica, en de opioïdereceptor, die het doelwit vormt voor pijnmedicatie. De vraag is of de technologische ontwikkelingen in de structuurbepaling van GPCRs ook toepassingen zullen vinden voor andere essentiële families van membraaneiwitten, zoals ionenkanalen, transporters en pompen. De toekomst zal ook uitwijzen of de kennis van deze driedimensionale structuren de zoektocht naar nieuwe geneesmiddelen zal vergemakkelijken.

S.G. Rasmussen, H.J. Choi, J.J. Fung, E. Pardon, P. Casarosa, P.S. Chae, B.T. Devree, D.M. Rosenbaum, F.S. Thian, T.S. Kobilka, A. Schnapp, I. Konetzki, R.K. Sunahara, S.H. Gellman, A. Pautsch, J. Steyaert, W.I. Weis, B.K. Kobilka, ‘Structure of a nanobody-stabilized active state of the β(2) adrenoceptor’ in: Nature, 2011, 469 (7329), 175-80.
S.G. Rasmussen, H.J. Choi, D.M. Rosenbaum, T.S. Kobilka, F.S. Thian, P.C. Edwards, M. Burghammer, V.R. Ratnala, R. Sanishvili, R.F. Fischetti, G.F. Schertler, W.I. Weis, B.K. Kobilka, ‘Crystal structure of the human beta2 adrenergic G-protein-coupled receptor’ in: Nature, 2007, 450 (7168), 383-7.

Chris Ulens is als neurobioloog verbonden aan de KU Leuven.

Deel dit artikel
Gerelateerde artikelen