slechts tweeënhalf jaar geleden hebben ips-cellen of ‘induced pluripotent stem cells’ hun intrede in het stamcelonderzoek gedaan. meteen zorgden ze voor menige spraakmakende publicatie zowel in de stamcelwereld als daarbuiten. intussen worden die cellen als een nieuwe hoeksteen beschouwd in het onderzoek. ze zijn bijzonder nuttig om inzicht te verwerven in hoe bepaalde ziektes ontstaan en bieden erg interessante perspectieven voor de behandeling van tot nog toe ongeneeslijke ziektes.

Pluripotente stamcellen op maat gemaakt?

Aernout Luttun

De ontwikkeling van zoogdieren begint vanuit één ‘almachtige’ cel – de bevruchte eicel – die de nodige (epi)genetische informatie in zich draagt om uit te groeien tot een complex levend wezen dat uit meerdere miljoenen cellen is opgebouwd (ongeveer 5 miljard in de mens) en waarin we op zijn minst 220 gespecialiseerde celtypes kunnen onderscheiden. Dit wonderlijke specialisatieproces wordt ‘differentiatie’ genoemd en verloopt via een aanzienlijk aantal tussenstappen. Een van de belangrijke tussenstations is de vorming van een blastocyste. Dit is een ‘hol balletje’ dat bestaat uit één laag cellen die binnenin een klompje cellen (‘ICM’ of ‘inner cell mass’) bevat. Die cellen, de embryonale stamcellen, zijn net iets minder ‘machtig’ dan een bevruchte eicel omdat ze niet langer in staat zijn om de extra-embryonale weefsels (zoals de placenta) te vormen. Ze zijn echter wel nog in staat om alle gespecialiseerde cellen te vormen. Omwille van die veelzijdigheid (‘pluripotentie’) zijn die stamcellen bijzonder interessant, niet alleen om te begrijpen hoe een levend wezen zich ontwikkelt, maar ook om ze te gebruiken als behandeling voor tal van ziektes waarbij bepaalde functionele cellen onherroepelijk afsterven of defecten vertonen. De mogelijkheid om die cellen uit een blastocyste te isoleren (eerst uit een muis en pas veel later uit een mens) en verder te kweken in een kweekschaaltje was dan ook een belangrijke mijlpaal in het stamcelonderzoek. Maar niet iedereen deelde dit enthousiasme, omdat tegenover elke nieuwe derivatie van embryonale stamcellen de opoffering van een ontluikend levend wezen staat. Als men bovendien denkt aan het gebruik van embryonale stamcellen voor therapie zijn er nog twee andere hindernissen. De cellen hebben een ander immunologisch paspoort, waardoor ze kunnen worden afgestoten door het lichaam van de patiënt. Ze hebben bovendien ook de eigenschap om (goedaardige) tumoren te vormen wanneer ze in hun pluripotente (dus niet gedifferentieerde) vorm in de patiënt worden getransplanteerd.

De mogelijkheid om embryonale stamcellen uit een blastocyste te isoleren en verder te kweken in een kweekschaaltje was een mijlpaal in het stamcelonderzoek

Omwille van die negatieve ethische connotaties en het dichtdraaien van de federale geldkraan voor onderzoek naar embryonale stamcellen in de Verenigde Staten in 2001 is men op zoek gegaan naar alternatieven. Een centrale vraag hierbij was of het mogelijk is om ook vertrekkend van volwassen weefsels cellen te bekomen met pluripotente eigenschappen. Lang heeft men gedacht dat de stamcellen die we terugvinden in volwassen weefsels niet dezelfde veelzijdigheid vertonen als hun embryonale tegenhangers. Volwassen stamcellen waren hoogstens ‘multipotent’ of ‘unipotent’, wat wil zeggen dat ze slechts een beperkt aantal functionele cellen kunnen maken die tot hetzelfde weefseltype of slechts één celtype behoren. De meest gekende multipotente volwassen stamcel is de ‘hematopoïetische’ stamcel, die kan differentiëren tot elk type bloedcel (witte bloedcellen, rode bloedcellen en bloedplaatjes). In 2002 kwam er verandering in die opvatting toen onderzoekers van het Stem Cell Institute in Minneapolis onder leiding van de Vlaamse onderzoekster Catherine Verfaillie een celtype hadden geïsoleerd uit beenmerg van een volwassen persoon, dat in staat was zich te specialiseren in verschillende functionele cellen van verschillende weefsels. Dit liet vermoeden dat er in een volwassen lichaam toch nog stamcellen bestaan met een veelzijdigheid (‘plasticiteit’) die mogelijk die van een embryonale stamcel benadert maar wellicht niet evenaart. Die cellen werden dan ook voorzichtigheidshalve ‘multipotente adulte progenitor cellen’ (MAP-cellen) genoemd. Er bleef echter één belangrijke vraag open omtrent die cellen: bestaan de MAP-cellen in hun veelzijdige vorm als dusdanig echt in het beenmerg, of gaat het om een celtype dat zijn veelzijdigheid heeft ontwikkeld gedurende het langdurige kweekproces in het labo? Anders gezegd, is het mogelijk om via bepaalde manipulaties in het kweekproces vanuit een volwassen weefselcel, in dit geval een beenmergcel, een cel te maken die de klok heeft teruggedraaid en zich heeft omgezet naar een meer primitieve pluripotente vorm?

Het antwoord op deze vraag is wellicht positief. Er zijn immers nog een aantal andere meer recente voorbeelden gekend waarbij bepaalde cellen uit een volwassen lichaam pluripotente eigenschappen gingen vertonen na het in kweek brengen van de cel. Zo slaagde een groep Duitse onderzoekers erin om uit volwassen testes cellen te kweken met eigenschappen die heel sterk leken op die van embryonale stamcellen. Naast het opleggen van stringente kweekomstandigheden zijn er op zijn minst nog drie andere manieren om een volwassen cel te ‘herprogrammeren’ tot een pluripotente cel. De eerste methode werd geïntroduceerd rond dezelfde tijd waarin MAP-cellen voor het eerst werden beschreven. Twee onderzoekslaboratoria (in Florida, VS en in Edinburgh, UK) toonden aan dat het mogelijk is om een volwassen cel te laten samensmelten met een embryonale stamcel (‘celfusie’). Het resultaat is een cel die zich gedraagt als een embryonale stamcel, ondanks het feit dat ze nog steeds het genetische materiaal van de volwassen cel in zich draagt. Hoewel dit bijdraagt tot ‘proof-of-principle’ dat het mogelijk is een volwassen nucleus te herprogrammeren tot een pluripotente status (in zowel muizen als mensen), is een dergelijke benadering voor therapie niet haalbaar. Er is immers een gevaar verbonden aan de aanwezigheid van een ‘dubbele portie’ erfelijk materiaal (DNA) in deze fusiecellen (dat van de embryonale stamcel en dat van de volwassen cel). Bovendien is er voor deze methode nog altijd nood aan embryonale stamcellen.

Voor de tweede methode, meteen de oudste manier, moeten we teruggaan naar het midden van de vorige eeuw toen onderzoekers voor het eerst nucleaire transfer (NT) uitvoerden in oöcyten (onbevruchte eicellen) van kikkers. Hierbij werd de kern van een volwassen cel ingeplant in een cytoplast (een oöcyt waaruit eerst de eigen celkern werd verwijderd). Na verdere ontwikkeling van deze gewijzigde oöcyten kwamen kikkervisjes tot stand die genetisch identiek waren aan de volwassen kikker die als donor voor de celkern had gefungeerd. Het principe van kloneren was geboren. Geruime tijd later (eind jaren negentig) werd hetzelfde principe met succes toegepast op zoogdieren, waarvan het schaap Dolly het meest gekende voorbeeld is. Zoals in het tijdperk van embryonale stamcellen kon men opnieuw gaan dromen van de mogelijkheid om over pluripotente cellen te beschikken, die dit keer echter geen immunologische problemen zouden geven omdat ze genetisch identiek zijn aan de patiënt bij wie ze eventueel zouden worden getransplanteerd. Bovendien moesten er niet langer embryo’s worden vernietigd voor de derivatie ervan, een onbevruchte eicel was voldoende. Tot op vandaag is deze kloneringstechniek evenwel niet succesvol gebleken in mensen. Een Koreaanse groep had enkele jaren geleden beweerd van wel, maar moest die bewering terugtrekken omdat het onderzoek op wetenschappelijke fraude was gebaseerd. Eens dit wel mogelijk is, blijven we met een aantal problemen zitten. De kloneringstechniek is bijzonder inefficiënt en technisch zeer veeleisend. Menselijke oöcyten zijn schaars en het wordt wellicht niet eenvoudig om dit op grote schaal te gaan ontwikkelen. En zelfs als hier het probleem van het vernietigen van embryo’s wordt omzeild, rijst er met de kloneringstechniek een ander ethisch probleem, namelijk dat die techniek niet alleen in een therapeutische context zou kunnen worden aangewend, maar ook voor reproductieve doeleinden. Het is inderdaad niet ondenkbaar dat het Dollyverhaal een menselijk staartje zou krijgen. Een sluitende regelgeving omtrent deze techniek zal dan ook van groot belang zijn.

De derde methode om pluripotentie te induceren heeft in 2006 een nieuwe wind doen waaien in de stamcelwereld: het maken van ‘induced pluripotent stem cells’ of iPS-cellen via direct herprogrammeren van volwassen cellen op basis van een combinatie van transcriptiefactoren, dit zijn eiwitten die in de kern van de cel binden aan het erfelijke materiaal (het DNA). Vele stamcelonderzoekers, maar ook ethici, waren zeer opgetogen toen Shinya Yamanaka zijn ‘recept’ voorstelde voor het maken van wat hij ‘iPS-cellen’ noemde. Startend met twee dozijn kandidaat-factoren voor pluripotentie kwam hij via systematische eliminatie uiteindelijk tot een combinatie van vier transcriptiefactoren – ook wel eens ‘the fantastic four’ genoemd – die voldoende zijn om een volwassen cel te ‘hersenspoelen’ tot een pluripotente cel die zeer sterk lijkt op een embryonale stamcel. Aanvankelijk ging het om fibroblasten (afkomstig uit de staart van een volwassen muis) die geherprogrammeerd werden doordat er aan het erfelijke materiaal van die cellen vier genen (stukjes DNA coderend voor vier transcriptiefactoren, met name Oct4, Sox2, c-Myc en Klf4) extra werden toegevoegd met behulp van retrovirussen. Dit zijn virussen die de eigenschap bezitten om zich spontaan in te bouwen in het erfelijke materiaal van een cel nadat de cel door die virussen eerst werd binnengedrongen – een proces dat in vaktermen ‘retrovirale transductie’ wordt genoemd. Die ‘eerste generatie’ iPS-cellen waren evenwel nog niet volledig geherprogrammeerd aangezien ze na inplanting in een blastocyste geen aanleiding gaven tot levende chimeren, hybride muizen waar een deel van de weefselcellen afgeleid is van de geïmplanteerde cellen en het overige deel van de blastocyste zelf. Dit is iets wat een embryonale stamcel wél zou doen.

Men vond een methode om pluripotente cellen te maken die bijna identiek zijn aan embryonale stamcellen, maar met het immunologische paspoort van de patiënt

In een tweede reeks studies lukte dit wel, door de vorming van iPS-kolonies traceerbaar te maken via een vernuftig systeem op basis van resistentie van de volwaardig geherprogrammeerde klonen tegen bepaalde chemicaliën. Amper een jaar later slaagden twee onderzoeksgroepen – de groep van Shinya Yamanaka zelf aan de universiteit van Kyoto in Japan en de groep van James Thomson van de University of Wisconsin-Madison, VS, die als eerste humane embryonale stamcellen deriveerde – erin om humane iPS-cellen te maken. Opnieuw had men een methode gevonden om pluripotente cellen te maken die bijna identiek zijn aan embryonale stamcellen, maar met het immunologische paspoort van de patiënt. Alleen leek de procedure dit keer technisch ‘relatief eenvoudig’ te zijn. Zo eenvoudig dat zelfs Ian Wilmut, de onderzoeker die indertijd Dolly ter wereld had geholpen, prompt overschakelde van nucleaire transfer op deze iPS-methode. Zeer velen hebben snel zijn voorbeeld gevolgd. iPS-cellen zijn dan intussen ook een echte ‘rage’ aan het worden. Het jaarlijkse congres van het toonaangevende ISSCR (International Society for Stem Cell Research) in 2008 in Philadelphia stond bijna volledig in het teken van iPS. Rudolf Jaenisch, een autoriteit op het gebied van celherprogrammering, gaf aan het einde van het congres een overzicht over het iPS-gebeuren en rondde zijn slotbetoog glimlachend af met de bemerking: ‘Ik kan jullie ten stelligste aanraden de term iPS in de titel van jullie abstract voor de volgende ISSCR-editie te zetten …’ Hijzelf was de eerste om aan te tonen dat de iPS-technologie in muizen kan worden gebruikt om ziektes te behandelen die hun oorsprong vinden in een genetisch defect. In dit geval ging het om sikkelcelanemie, een aandoening veroorzaakt door een mutatie in het hemoglobinegen, waarbij de rode bloedcellen de vorm aannemen van een sikkel doordat er een abnormale variant van hemoglobine wordt aangemaakt. Eerst werden iPS-cellen gemaakt van muizen met sikkelcelanemie, waarna het foutieve hemoglobinegen vervangen werd door het correcte gen. Vervolgens werden hematopoïetische voorlopercellen gemaakt uit de gecorrigeerde iPS-cellen die dan getransplanteerd werden in de zieke muizen.

Net zoals met de andere methodes in de zoektocht naar pluripotentie zijn er ook aan deze methode nadelen verbonden

Als men op dit tempo doorgaat, lijkt het gebruik van iPS-cellen voor het genezen van tot nog toe ongeneesbare ziektes binnen handbereik. Of misschien toch niet? Net zoals met de andere methodes in de zoektocht naar pluripotentie zijn er ook aan deze methode nadelen verbonden. De meeste huidige studies zijn er dan ook op gericht ‘nieuwe generatie’ iPS-cellen te maken waarbij die nadelen zoveel mogelijk worden omzeild. Een eerste nadeel is dat er in het oorspronkelijk ‘recept’ gebruikgemaakt wordt van retrovirale transductie:overdracht van retrovirussen voor het overdragen van de vier transcriptiefactoren. Virale integratie in het DNA van iPS-cellen kan ongewenste effecten teweegbrengen, zoals eerder reeds werd gezien in de eerste klinische studies met gentransfer waarbij sommige patiënten kanker ontwikkelden. Daarom heeft men recent drie methodes bedacht die toelaten om de vier factoren tijdelijk te introduceren in de cel zonder dat er viraal DNA geïntegreerd wordt: adenovirale gentransfer, non-virale gentransfer via plasmides en het gebruik van chemicaliën (‘small molecules’). Nog een hinderpaal is dat bepaalde van de vier factoren die nodig zijn voor het induceren van pluripotentie – volgens sommige auteurs zelfs alle vier – de eigenschap hebben kanker te kunnen verwekken, los van de effecten van virale integratie. Vooral c-Myc lijkt het voorkomen van kanker aanzienlijk te verhogen in muizen die uit iPS-cellen van de ‘eerste generatie’ gemaakt zijn. Een eerste stap was dan ook na te kijken of het niet mogelijk was c-Myc uit de transcriptiecocktail te schrappen. Dit bleek uiteindelijk mogelijk, zij het dan ten koste van de efficiëntie waarmee iPS-cellen konden worden verkregen. De groep van James Thomson gebruikte bovendien een andere combinatie van factoren waarin Klf4 en het kankerverwekkende c-Myc werden vervangen door Lin28 en Nanog. Nog recenter bleek het zelfs voldoende om twee factoren te gebruiken voor het induceren van pluripotentie mits enige bijkomende ‘hulpmiddelen’. Een combinatie van Oct4 met Klf4 bleek bijvoorbeeld voldoende te zijn als men vertrok van neuronale voorlopercellen (stamcellen uit de hersenen die zich kunnen specialiseren bijvoorbeeld tot zenuwcellen), omdat die van nature reeds Sox2 tot expressie brengen. Dit heeft dan weer het nadeel dat neuronale voorlopercellen niet zo eenvoudig te bekomen zijn als bindweefselcellen uit de huid. Wanneer echter valproïnezuur (een middel dat het DNA-materiaal meer toegankelijk maakt voor herprogrammering) werd gebruikt, bleek een combinatie van Oct4 en Sox2 in huidfibroblasten te volstaan om volwaardige iPS-cellen te maken. Onlangs werd nog een nieuwe pluripotentiefactor voorgesteld, Esrrb, die samen met Oct4 en Sox2 succesvol iPS-cellen kon genereren.

Zo raken we dus verbazend snel dichter bij het gebruik van iPS-cellen in therapie. Maar laten we vooral niet vergeten dat zelfs als alle nadelen verbonden aan iPS uit de wereld zijn geholpen, we nog altijd te doen hebben met een pluripotente stamcel. Deze nieuwe technologie houdt de belofte in dat we kunnen beschikken over een stamcel die op maat van elke patiënt kan worden gemaakt en die geen opoffering vereist van embryo’s, maar toch moeten we er blijven mee rekening houden dat een dergelijke cel de teugels kan verliezen na transplantatie en aanleiding kan geven tot een tumor. Men kan dit vermijden door vooraf deze cellen te prespecialiseren naar de gewenste celtypes, maar ook daarvoor is nog veel zoekwerk nodig om het juiste differentiatierecept te vinden. Laten we evenwel ook niet vergeten dat deze cellen bijzonder nuttig zullen zijn om inzicht te verwerven in hoe ziektes ontstaan en op die manier aan de grondslag kunnen liggen voor het vinden van nieuwe behandelingen voor deze ziektes. Twee recente publicaties hebben aangetoond dat het inderdaad mogelijk is uit patiënten met uiteenlopende en genetisch complexe aandoeningen, onder meer diabetes en de spierziekte ALS (amyotrofe laterale sclerose), iPS-cellen te maken die als studiemodel kunnen fungeren voor deze ziektes (sommigen verwijzen hiernaar als ‘disease-in-a-dish’). Laten we in elk geval hopen dat de ‘iPS-sneltrein’ op tijd en stond eens blijft stilstaan.

Takahashi et al., ‘Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors’, in: Cell, 2007, 131: 861-872.

Park et al., ‘Disease-specific induced pluripotent stem cells’, in: Cell, 2008, 134: 877-886.

Aernout Luttun is als onderzoeker verbonden aan de KU Leuven.