Deel dit artikel

Schommelingen in de proteïneconcentratie van genetisch identieke cellen worden ruis genoemd. Dergelijke ruis op moleculair niveau is onvermijdelijk en wordt steeds vaker beschouwd als een belangrijk aspect van de regulatorische netwerken in een cel. Hij speelt zelfs een sleutelrol in de ontwikkeling van weefsel, in de evolutie en in de epigenetica.

Ruis in de cel (#38)

Meer dan een stoorzender

annemie geeraerd en bram van de poel

Een levende cel is een complex geheel dat verschillende duizenden types proteïnen bevat. Elk proteïne kan worden beschouwd als een moleculaire machine op nanometerschaal die toelaat een specifieke taak met een grote precisie tot een goed einde te brengen. Zo zal bijvoorbeeld een proteïne als sucrase het tweevoudige suiker sucrose omzetten in twee enkelvoudige suikers: glucose en fructose. De concentratie van proteïnes verandert voortdurend door nieuwe omgevingscondities, bijvoorbeeld een wijziging in de aanwezige voedingsstoffen. Cellen spelen daar snel op in door via moleculaire netwerken de verworven informatie te verwerken om zo keuzes te maken rond het aantal en het type van proteïnen die nodig zijn voor overleving en groei. De cel kan het ontstaan van spontane, stochastische schommelingen in de hoeveelheid en de activiteit van proteïnen echter niet vermijden. Zo kan de concentratie van een proteïne in een populatie van genetisch identieke cellen variëren tot enkele tientallen procenten. Dergelijke schommelingen in proteïneconcentratie worden ruis genoemd. Dit fenomeen wordt meer en meer geapprecieerd als een belangrijk aspect in een cel, en niet louter als een foutje in deterministische handboekbeschrijvingen. Ruis is van belang in alle types cellen en speelt een sleutelrol in weefselontwikkeling, kanker en processen van evolutie.

Om te kunnen beschrijven welke mogelijkheden de cel heeft om ruis te controleren en wat het belang is van ruis, is eerst een conceptueel begrip nodig van ruis bij genexpressie. Genexpressie is het meest fundamentele proces dat het genotype (de specifieke DNA-code van ieder organisme) verbindt met het fenotype (observeerbare karakteristieken, zoals de oogkleur bij de mens). De genetische informatie in cellen, gevat in de DNA-code, wordt deels gebruikt om eiwitten aan te maken. In een eerste stap, de transcriptie, wordt de DNA-code omgezet in het zogenaamde messenger RNA (of mRNA). In een tweede stap, de translatie, bindt het mRNA zich aan ribosomen, dit zijn celcomponenten die als specifieke taak hebben om aminozuren te assembleren tot proteïnen en dit volgens de blauwdruk gevormd door het mRNA. Voor die delen in het DNA die coderen voor proteïnen duidt de term genexpressie op het gecoördineerde proces van transcriptie en translatie. De tijd die nodig is voor de transcriptie van één gen is typisch ongeveer de helft van de tijd die nodig is voor de translatie van het overeenkomstige mRNA. In de bacterie Escherichia colizijn dit ongeveer één minuut en twee minuten, respectievelijk, waarbij het mRNA zelf een levensduur heeft van twee tot vijf minuten.

Voor het begrijpen van ruis op het niveau van genexpressie zijn recent drie concepten voorgesteld op basis van experimenteel en theoretisch werk. Een eerste concept wordt gevormd door stochastische uitbarstingen. De promotor van het betrokken gen (een DNA-element dat de transcriptie van dat gen reguleert) blijkt stochastisch te verspringen tussen een ‘aan-’ en ‘uit’-status voor omzetting naar mRNA. Die mRNA-uitbarstingen worden vervolgens bijkomend versterkt tot proteïne-uitbarstingen, omdat elk individueel molecule mRNA tijdens zijn relatief lange levensduur vele malen opnieuw wordt gebruikt. Het gemiddelde expressieniveau van een bepaald gen (het aantal exemplaren van de overeenkomstige proteïne dat binnen een bepaalde tijd ontstaat) wordt bepaald door het product van promotoractiviteit, transcriptie en translatie. Vooral de eerste twee (snelle) stappen zijn onderhevig aan ruis. Dergelijke uitbarstingen komen voor in bacteriën, gisten, zoogdiercellen en embryo’s en worden de intrinsieke ruis genoemd. Deze ruis zal er dus altijd zijn, ongeacht omgevingsfactoren.

Een tweede concept is uitmiddeling in de tijd. De levensduur van een proteïne is meestal langer dan de tijd tussen twee opeenvolgende uitbarstingen van proteïneproductie. Daardoor zal de variabiliteit in proteïneconcentratie door de uitbarstingen uitgemiddeld worden.

Als derde concept wordt propagatie of extrinsieke ruis voorgesteld. De snelheid van genexpressie wordt beïnvloed door de aanwezigheid en de activiteit van zeer specifieke genregulerende eiwitten, ook wel transcriptiefactoren genoemd. Ook andere regulerende proteïnen stroomopwaarts in het regulatienetwerk, die zelf ook onderhevig zijn aan ontladingen en uitmiddelingen in de tijd, kunnen de genexpressie beïnvloeden. Schommelingen in de expressie van één gen hebben dus effecten op andere genen stroomafwaarts. In bacteriën kon worden aangetoond dat dergelijke trage processen opwaarts in het genetisch regulatiemechanisme verantwoordelijk kunnen zijn voor langetermijneffecten verder stroomafwaarts in de keten. Kortom, ruis op moleculair niveau lijkt onvermijdelijk.

Welke mogelijkheden heeft de cel om moleculaire fluctuaties of moleculaire ruis te controleren? Om dit te ontrafelen staan we eerst wat uitgebreider stil bij de verschillende regulatorische netwerken rond transcriptiefactoren die aanwezig zijn in een cel. Cellen leven in een complexe omgeving en kunnen vele verschillende signalen uit hun omgeving waarnemen: fysische signalen (temperatuur, osmotische druk), biologische signaalmoleculen van andere cellen, nutriënten en potentieel toxische moleculen. Zo delen cellen van dieren bijvoorbeeld pas nadat ze zijn blootgesteld aan hormonen (groeifactoren). Informatie over de interne toestand van een cel, zoals de concentratie van belangrijke proteïnen en interne schade (bijvoorbeeld schade aan het DNA, membraan- of proteïneschade) is ook belangrijk. Cellen reageren op al die signalen door het aanmaken van gepaste proteïnen die reageren op die interne of externe signalen. Om de actuele toestand weer te geven gebruikt een levende cel transcriptiefactoren (de al eerder vermelde zeer specifieke genregulerende eiwitten). Transcriptiefactoren zijn typisch zo ontworpen dat ze snel tussen een actieve en inactieve status kunnen switchen, en de switchsnelheid wordt beïnvloed door een intern of extern signaal. Elke transcriptiefactor bindt aan de promotor van een gen en reguleert zo de snelheid waarmee het gen afgeschreven wordt tot mRNA, dat op zijn beurt vertaald wordt tot een proteïne. De activiteiten van de transcriptiefactoren in een cel kunnen worden beschouwd als een interne voorstelling van de omgeving. Escherichia coli bijvoorbeeld heeft ongeveer 300 transcriptiefactoren die de snelheid van afschrijven reguleren voor ongeveer 4 000 proteïnen. De interactie tussen transcriptiefactoren en genen wordt beschreven via een transcriptienetwerk, dat opereert op een relatief trage tijdschaal:maximaal de tijd van één celgeneratie, die voor E.coli van 30 minuten tot verschillende uren of zelfs dagen bedraagt, afhankelijk van de omgeving.

De cel bevat echter ook signaaltransductienetwerken, die op een veel kortere tijdschaal reageren. Zij beschrijven de tussenstappen tussen het externe of interne signaal en de aanmaak van de gepaste transcriptiefactoren. De input van een signaaltransductienetwerk wordt typisch gedetecteerd door een receptormolecule dat doorheen de celmembraan loopt. Het buitenste gedeelte detecteert specifieke moleculen, die zich binden op de receptor, daar een conformatieverandering teweegbrengen en zo het gedeelte binnen de cel activeren. Die activering leidt tot een wijziging (bijvoorbeeld een fosforylering) van een signaalmolecule dat zich verspreidt in de cel. Die wijziging kan worden beschouwd als het doorgeven van een bit informatie van de receptor aan het signaalmolecule. Op zijn beurt kan het signaalmolecule een tweede signaalmolecule wijzigen, enzovoort. De hele cascade culmineert in de wijziging van een specifieke transcriptiefactor, en dit op enkele seconden tot minuten. Ondanks die snelle responstijd is het toch belangrijk te beseffen dat elke stap in de cascade wordt uitgevoerd met een eindige snelheid. De totale informatietransfer in de cascade wordt beperkt door de traagste stap, of, in deze context, de stap waarbij het betrokken signaalmolecule in de kleinste aantallen aangemaakt wordt. Op basis van modellering, met name via concepten uit de controle- en informatietheorie, kan worden bewezen dat de cel moleculaire fluctuaties in de concentratie van een proteïne (bijvoorbeeld een transcriptiefactor) niet volledig kan wegwerken. Een cascade die bestaat uit vijf stappen moet minstens 25 keer meer actieve signaalmoleculen aanmaken om eenzelfde informatieoverdracht te verwezenlijken als een cascade bestaande uit één stap. Dit effect van informatieverlies kan – oppervlakkig gezien – aan ruispropagatie doen denken, maar de achtergrondprincipes zijn verschillend. In feite veroorzaken mechanismen die ruispropagatie tegengaan (zoals uitmiddeling over de tijd) een groter verlies van informatie, terwijl mechanismen die het informatieverlies tegengaan (bijvoorbeeld sterke alles-of-niets effecten van één enkel signaalmolecule) net de ruis zullen versterken. Een grotere variatie (of ruis) op intermediaire signaalmoleculen duidt dus niet noodzakelijk op verminderde precisie, maar op strategieën om informatieverlies tegen te gaan, zodat meer controle mogelijk is op de concentratie van moleculen op het einde van de cascade.

Wat zijn nu de biologische gevolgen van deze onvermijdelijke moleculaire ruis? Een tot de verbeelding sprekende rol is te vinden in de stochastische differentiatie (of willekeurige ontwikkeling) van een initieel homogene populatie cellen. Dit laat de cel toe om verschillende mogelijke reacties op veranderingen in de omgeving te ontplooien, en energie op een meer efficiënte manier te spenderen dan in een puur deterministisch systeem. Bijvoorbeeld, de mogelijkheid om willekeurig te switchen tussen een aantal fysiologische toestanden van een cel is belangrijk bij celontwikkeling, als reactie op stress uit de omgeving, en in het bijzonder bij de ontwikkeling van kanker en bacteriële infecties. Dit willekeurige switchen biedt voordelen in een omgeving waar onverwachte veranderingen kunnen optreden, en is optimaal wanneer de tijd nodig voor de cel om zich aan te passen dezelfde is als de tijd waarmee de omgeving verandert, of, met andere woorden, wanneer de tijdsconstante van de switch in overeenstemming is met de typische tijdsschaal van omgevingsfluctuaties.

De mogelijkheid om willekeurig te switchen tussen een aantal fysiologische toestanden van een cel is belangrijk bij celontwikkeling en als reactie op stress uit de omgeving

Eén van de meest bestudeerde systemen, waarbij ruis leidt tot het samen bestaan van twee verschillende fysiologisch stabiele toestanden, is het systeem voor lactoseafbraak dat gereguleerd wordt via de ‘lac repressor’ in de bacterie Escherichia coli. Vereenvoudigd kan de werking als volgt worden beschreven. De lac repressor is een regulatorisch molecule dat op het DNA gebonden is op een manier die de transcriptie van lactase verhindert, zolang glucose zelf aanwezig is (lactase is een enzym noodzakelijk voor de eerste stap in het metaboliseren van het tweevoudige suiker lactose, namelijk splitsen in galactose en glucose). Met andere woorden, de lac repressor voorkomt de aanmaak van de proteïne lactase zolang er glucose waargenomen wordt. Zo wordt verzekerd dat de cel geen energie stopt in het produceren van enzymen die op dat moment niet nuttig zijn. Als er door een veranderende omgevingsfactor plots lactose aanwezig is, bindt de lactose met de lac repressor, waardoor die van vorm verandert en het DNA niet meer kan blokkeren. De omzetting van lactose tot glucose wordt niet meer onderdrukt en komt dan op gang via een positieve terugkoppelregeling. Het aantal moleculen van de lac repressor kan variëren tussen verschillende cellen in eenzelfde populatie, zodat sommige cellen niet voldoende de lactase-inhibitie ondervinden en dus toch lactase kunnen aanmaken, zelfs als er geen lactose aanwezig is. Dit leidt tot kleine uitbarstingen van lactase. Die moleculaire, stochastische ruis is nodig omdat er op deze manier ook andere belangrijke proteïnen kunnen worden aangemaakt.

Escherichia coli kan ook spontaan switchen naar een toestand waarbij de cellen ongevoelig worden voor antibiotica. Uit recent onderzoek blijkt dat kankercellen ook een willekeurige maar blijvende switch kunnen vertonen. Veelbelovend is dat deze switch in eukaryote cellen lijkt af te hangen van enzymen die de histonen wijzigen, dit zijn proteïnen die verantwoordelijk zijn voor de structurele organisatie van DNA in de celkern. Nu blijkt dat als wijzingen in de histonen verhinderd worden, er geen blijvende toestand van de kankercellen optreedt.

Er zijn ook voorbeelden waarbij de overgang van de ene toestand naar de andere niet willekeurig is, maar bepaald wordt door een ruis-geïnduceerde wijziging die een minimaal niveau haalt. In Bacillus subtilis bijvoorbeeld lijkt de differentiatie in een toestand die de cel toelaat DNA uit de omgeving op te nemen, gedetermineerd te worden door de regulator ComK. Die proteïne ComK zal zijn eigen aanmaak positief stimuleren, waardoor er een snelle respons kan ontstaan (het signaal wordt steeds versterkt door zichzelf). Dit leidt echter tot een vermindering van ComS, dat de afbraak van ComK indirect remt en dus een (tragere) negatieve terugkoppeling vormt. Met andere woorden, ComK zal geleidelijk meer worden afgebroken. Terwijl de positieve terugkoppeling van belang is voor het al dan niet halen van het minimale niveau, is het de negatieve terugkoppeling die de duur van de genetische competentietoestand bepaalt. Beide delen van het systeem worden dus onafhankelijk van elkaar – maar wel ruis-geïnduceerd – aangestuurd.

Cellen kunnen ook uitstelgedrag vertonen: differentiatieprocessen die relatief veel tijd vragen (bijvoorbeeld de aanmaak van sporen bij bacteriën of celdood in zoogdiercellen) verlopen stapsgewijs en volgens een ruisgevoelig initiatieproces. Dit is interessant als de omgeving ondertussen terug zou veranderen in een meer gunstige toestand, zodat het differentiatieproces misschien niet meer nodig is en de cel op een aantal stappen kan terugkeren.

Laten we even stilstaan bij differentiatie in stamcellen om een ander voorbeeld van moleculaire ruis te illustreren. Stamcelpopulaties zijn niet homogeen, maar bestaan uit cellen met zogenaamde subtoestanden, waarbij sommige cellen al een grotere kans hebben om te differentiëren naar één van de finale celtoestanden dan andere cellen. Trage veranderingen in genexpressieniveaus of subtoestanden kunnen helpen om twee gerelateerde objectieven te coördineren. Op korte termijn kan een signaal een respons uitlokken in een fractie van de stamcellen, namelijk die cellen van een bepaalde subtoestand. Op langere termijn kan de dynamische herverdeling tussen de verschillende subtoestanden een populatie met alle responsmogelijkheden hercreëren, waarbij opnieuw slechts een fractie van de cellen zal reageren op een eventueel gewijzigde omgevingsfactor. Hiervoor is verder experimenteel onderzoek nodig, gekoppeld aan wiskundige modelsimulaties die de stochastische overgangen tussen subtoestanden correct vatten. FISH (Fluorescence in situ hybridization) waarmee de ruimtelijke en tijdsafhankelijke wijzigingen in mRNA in een levende cel experimenteel kan worden onderzocht, is een veelbelovende methode voor de identificatie van toestanden en subtoestanden.

De rol van ruis in de evolutie laat toe het aantal fenotypes te verruimen dat kan voorkomen uit één genotype

De rol van ruis in de evolutie laat toe het aantal fenotypes te verruimen dat kan voorkomen uit één genotype. Een eenvoudig voorbeeld van een door ruis ontstaan fenotype is het expressieniveau van een bepaald gen in een eencellig organisme. Dit fenotype is gekarakteriseerd door zijn gemiddelde expressie en onvermijdelijke ruis, waarbij beide kenmerken onder genetische controle staan van de cel zelf en ook aan evolutionaire selectiedruk van de omgeving onderhevig zijn. Als de omgevingsfactoren fluctueren is een hoger ruisniveau duidelijk voordelig, want dit laat meer adaptatiemogelijkheden toe. Maar wat als de selectie nu duidelijk in één richting wijst? Het resultaat blijkt af te hangen van de positie van het nieuwe, gewenste genexpressieniveau (door de selectiedruk) ten opzichte van de distributie van deze genexpressieniveaus. Stel dat er twee mogelijkheden zijn: een brede distributie (hoog ruisniveau) en een smalle distributie (laag ruisniveau) van de genexpressie, telkens met dezelfde totale oppervlakte onder de distributie (dus in totaal een vergelijkbare genexpressie). Als het gewenste genexpressieniveau van de omgevingsselectiedruk dicht bij de gemiddelde genexpressie ligt, dan biedt het lager ruisniveau voordelen: een groot deel van de mogelijke fenotypes haalt dan (minimaal) de gewenste waarde in genexpressie. De gerichte selectie leidt hier dus uiteindelijk tot minder ruis. Als het gewenste genexpressieniveau (op basis van de omgevingsselectiedruk) echter sterk afwijkt van de gemiddelde genexpressie, dan is een bredere distributie voordelig: er zullen dan toch minstens nog enkele geschikte fenotypes aanwezig zijn. Men zou dus kunnen concluderen dat er grotere fenotypische ruis te verwachten is in een periode waarbij adaptatie aan een nieuwe omgeving plaatsvindt, terwijl de ruis zal dalen in periodes waar de selectiedruk kleiner is. In hoever dit geïdealiseerde model het werkelijke verband tussen ruis en evolutie kan vatten, moet nog verder experimenteel worden onderzocht.

Een laatste beschouwing gaat over de rol van ruis in de ontwikkelingsevolutie. Een voorbeeld van ontwikkelingsevolutie is sporenvorming in Bacillus subtilis. Dergelijke bacteriële sporen bestaan uit DNA, een deel van het cytoplasma en zeer weerstandige buitenlagen, zodat ze eeuwenlang ‘slapend’ kunnen blijven en onder gunstige omstandigheden kunnen kiemen. Normaal gezien deelt de bacteriecel in een vroeg stadium van de sporenvorming in twee compartimenten van verschillende grootte, met in elk compartiment één chromosoom, dat de hele DNA-code draagt. Het kleinere compartiment ontwikkelt zich verder tot de spore op basis van een signaal dat vanuit het grotere compartiment gegeven wordt. Als nu blijkt dat bij een deel bacteriën van de gehele populatie dit essentiële signaal ontbreekt ten gevolge van ruis in de genexpressie van dit signaalmolecule, dan zal het grootste compartiment dadelijk opnieuw delen bij deze bacteriën. Deze bacteriecellen zullen dus twee keer zoveel sporen aanmaken in vergelijking met de bacteriën die hun sporenvorming normaal hebben doorlopen. Zo ontstaat er een subpopulatie waarbij een fractie meer chromosomen en/of meer compartimenten heeft. Deze subpopulatie kan dan stapsgewijs evolueren tot een grotere populatie waarbij elke bacteriecel uit twee sporen ontstaat in plaats van één, een situatie die de geschiktheid van de populatie om te overleven verbetert (tweemaal zoveel DNA-code of erfelijk materiaal). De rol van ruis in (ontwikkelings)evolutie is momenteel slechts een denkoefening.

Een pertinente vraag over ruis in genetische netwerken blijft vooralsnog onbeantwoord: hoe ontstaat ruis? Niet alle regulatorische netwerken rond proteïne-uitbarstingen zijn al ontrafeld. Bijvoorbeeld, microRNA (kleine korte RNA-fragmenten, lichaamseigen of opgenomen uit de omgeving) interageert met het eigenlijke mRNA van de cel en kan zo de translatie naar proteïnen zowel versterken als verzwakken. Dit is het domein van de epigenetica: overerfbare veranderingen in genexpressie die niet te wijten zijn aan wijzigingen in de DNA-code. Epigenetica veronderstelt dat wat we eten, hoe we leven en welke keuzes we maken, invloed heeft op de uiteindelijke expressie van onze genen en ons uiteindelijke fenotype. Epigenetica is relevant voor domeinen als ontwikkelingsbiologie, kanker of neuropsychiatrische aandoeningen zoals schizofrenie en autisme, maar heeft potentieel ook links met de gevolgen van omgevingsfactoren, de opvoeding en/of eventuele verslavingen in het verdere leven. Ethische vragen rond verantwoordelijkheid tussen generaties, eigen keuzevrijheid en de maatschappelijke gevolgen hiervan verdienen ruime aandacht. Liefst tegelijk met – of zelfs vooroplopend op – fundamenteel wetenschappelijk onderzoek naar de rol van ruis in de cel.

Avigdor Eldar en Michael B. Elowitz, ‘Functional roles for noise in genetic circuits’, in: Nature; 2010, 467, 7312, 167-173.

Ioannis Lestas, Glenn Vinnicombe en Johan Paulsson, ‘Fundamental limits on the suppression of molecular fluctuations’ in: Nature, 2010, 467, 7312, 174-178.

Annemie Geeraerd en Bram van de Poel zijn als bio-ingenieurs verbonden aan de KU Leuven.