Deel dit artikel

carriers zijn membraanproteïnen die het transport van een geneesmiddel doorheen celmembranen op een selectieve manier mogelijk maken. hun bijdrage tot het ontstaan van resistentie bij kankertherapie is reeds lang gekend. geleidelijk aan is het echter ook duidelijk geworden dat voor talrijke geneesmiddelen de carriers ter hoogte van de darmwand en de lever een cruciale rol spelen bij de opname in het lichaam.

Het belang van carriers bij de ontwikkeling van medicijnen

Patrick Augustijns

De ontwikkeling van nieuwe geneesmiddelen heeft de laatste jaren een ware gedaanteverandering ondergaan. De synthese van nieuwe moleculen gebeurt sneller dan ooit op basis van combinatoriële technieken en computersimulaties. De binding van die nieuwe moleculen aan mogelijke doelwitten (zoals enzymen, receptoren) wordt in een volgende stap onderzocht via in vitro high-throughput screening. Zo kunnen op een snelle manier sterkbindende moleculen worden geïdentificeerd als mogelijke farmacologisch werkzame stoffen. Die nieuwe benadering heeft echter ook een belangrijk nadeel: vaak blijkt dat het sterkstbindende molecule niet tot een geneesmiddel kan worden ontwikkeld. Een succesvol geneesmiddel moet immers niet alleen een sterke binding vertonen met het doelwit, maar moet ook de plaats van werkzaamheid kunnen bereiken.

Het opbouwen van een bepaalde concentratie ter hoogte van het doelwit (farmacokinetiek) is het resultaat van verschillende processen die gelijktijdig verlopen: het oplossen van het geneesmiddel in het gastro-intestinale kanaal, de opname in het bloed doorheen de darmwand, de verdeling in het lichaam, het metabolisme ter hoogte van de darm en de lever en de uitscheiding via de nieren. Voor de meeste van die processen bestaan er in-vitromodellen die de in-vivoprocessen simuleren. Verschillende van die modellen worden momenteel geïmplementeerd bij de ontwikkeling van nieuwe geneesmiddelen. Zo wordt voorkomen dat ontwikkelingsprogramma’s in een later stadium voortijdig worden gestopt omwille van niet-geschikte farmacokinetische eigenschappen. De beschikbaarheid van deze in-vitromodellen liet ook toe om wetenschappelijke vraagstellingen op een nieuwe manier te benaderen. Dit heeft geleid tot een verbeterde kennis van onderliggende transportmechanismen. Zo is men tot de bevinding gekomen dat talrijke carriers betrokken zijn bij de eliminatie van geneesmiddelen. Carriers zijn membraanproteïnen die het transport van een geneesmiddel doorheen een celmembraan mogelijk maken. Een geneesmiddel kan dus een substraat zijn van één of meerdere carriers. Normaal gezien zorgen die carriers voor de huishouding van lichaamseigen stoffen, de opname van voedingsstoffen en de eliminatie van toxische stoffen. Ze blijken echter ook een belangrijke invloed te hebben op het farmacokinetische profiel van een geneesmiddel.

Normaal gezien zorgen carriers voor de huishouding van lichaamseigen stoffen, de opname van voedingsstoffen en de eliminatie van toxische stoffen

Een overzicht van de verschillende processen die zich afspelen ter hoogte van de darmwand en de lever geeft meteen aan hoe belangrijk carriers wel zijn. Nadat een geneesmiddel in de darmholte in oplossing is gegaan, is de darmwand de eerste belangrijke barrière die moet worden overwonnen. De dunne darm wordt afgelijnd door een enkelvoudige laag van cellen, waarvan de voornaamste de absorptiecellen zijn. Die cellen zijn verantwoordelijk voor de absorptie van zowel voedingsstoffen als geneesmiddelen. Het zijn sterk gepolariseerde cellen met een apicale membraan (in contact met de darmholte) en een basolaterale membraan (in contact met het bloed). De cellen zijn onderling nauw verbonden door tight junctions, zodat een moeilijk doorlaatbare barrière ontstaat tussen de darmholte en het bloed. Geneesmiddelen kunnen de darmwand passeren doorheen de cellen (transcellulair) of tussen de cellen (paracellulair). Paracellulair transport is beperkt omwille van de aanwezigheid van de tight junctions, zodat alleen kleine, goed wateroplosbare (of hydrofiele) moleculen langs deze weg kunnen passeren. Transcellulair transport van geneesmiddelen kan in eerste instantie gebeuren via passieve diffusie, waarbij de lipidendubbellaag van de celmembraan moet worden gepasseerd om in het bloed terecht te komen. Deze weg is vooral geschikt voor vetoplosbare (of lipofiele) moleculen.

Verschillende voedingsstoffen (glucose, aminozuren, dipeptide, vitaminen) zijn sterk hydrofiel en kunnen de celmembraan niet passeren via passieve diffusie. Voor hun snelle en efficiënte opname vanuit de dunne darm heeft de natuur in de intestinale cellen carriers ingebouwd die zorgen voor transport, zoals glucosecarriers, aminozuurcarriers en dipeptidecarriers. De observatie dat verschillende geneesmiddelen eveneens via die carriers worden opgenomen (bijvoorbeeld L-Me-Dopa via de aminozuurcarrier en sommige cephalosporines via de dipeptidecarrier) heeft onderzoekers ertoe gebracht deze opnamecarriers te betrekken bij de ontwikkeling van geneesmiddelen, met de bedoeling de opname van sterk hydrofiele kandidaat-geneesmiddelen te bevorderen via deze carriers. Een typisch voorbeeld is het antivirale geneesmiddel acyclovir, dat te hydrofiel is om een goede opname te garanderen. Door acyclovir te koppelen aan het aminozuur ‘valine’ wordt valacyclovir bekomen, wat een zeer goed substraat blijkt voor de dipeptidecarrier. Na opname wordt valacyclovir enzymatisch gesplitst en wordt het actieve acyclovir vrijgezet.

Naast het bestaan van verschillende carriers die de opname van hydrofiele moleculen bevorderen, bestaan er ter hoogte van de apicale membraan van intestinale cellen ook effluxcarriers, die de opname van bepaalde geneesmiddelen tegenwerken. De voornaamste effluxcarrier is het P-glycoproteïne (P-gp), dat eveneens een belangrijke rol speelt in meervoudige resistentie tegen verschillende types geneesmiddelen bij talrijke kankers. Zijn functie zou erin bestaan eventueel toxische bestanddelen uit de cel te pompen. Naast P-gp werden ook nog MRP2 (Multidrug Resistance-associated Protein) en BCRP (Breast Cancer Resistance Protein) ontdekt als effluxcarriers ter hoogte van de intestinale mucosa (of slijmvlies).

Modellen voor in-vitrocelcultuur werden in de jaren negentig ingevoerd voor de studie van geneesmiddelentransport ter hoogte van de darmwand. Het Caco-2-model is momenteel het best gekarakteriseerde en meest aanvaarde model dat representatief is voor de intestinale mucosa. Caco-2-cellen zijn een cellijn afkomstig van een humaan coloncarcinoom. Caco-2-cellen komen voor als sterk gepolariseerde cellen, met tussen de cellen goedontwikkelde tight junctions. Caco-2-monolagen komen niet alleen morfologisch overeen met de relevante intestinale cellaag, ze bevatten ook talrijke functionele carriers. Dit laat toe het effect van carriers op de opname van geneesmiddelen ter hoogte van de darmwand te onderzoeken.

Nadat een geneesmiddel de intestinale barrière heeft gepasseerd en de bloedcirculatie heeft bereikt, is de volgende barrière de lever

Binnen een reeks van nieuwe kandidaat-geneesmiddelen is het mogelijk aan de hand van een transportstudie in het Caco-2-model de component met de meest geschikte eigenschappen voor intestinale absorptie te selecteren. Nadat een geneesmiddel de intestinale barrière heeft gepasseerd en de bloedcirculatie heeft bereikt, is de volgende barrière de lever. De lever is een zeer efficiënt orgaan om vreemde stoffen uit het lichaam te verwijderen. Levercellen vertonen een duidelijke polariteit, waarbij de basolaterale kant in contact staat met het bloed en de apicale kant toegang geeft tot de galkanaaltjes. In de lever worden geneesmiddelen afgebroken via fase I-reacties (bijvoorbeeld oxidatie door Cytochroom P450) en fase II-reacties (bijvoorbeeld koppeling aan glucuronzuur). Beide reacties hebben tot doel de wateroplosbaarheid van de geneesmiddelen te verhogen en zodoende hun eliminatie te versnellen. De enzymen die betrokken zijn bij deze fase I- en fase II-reacties werden in het verleden reeds intensief onderzocht. Hun relatieve belang met betrekking tot de farmacokinetiek van geneesmiddelen werd vrij goed in kaart gebracht. Er bestaan ook algemene richtlijnen voor de farmaceutische industrie hoe het belang van deze enzymen kan worden nagegaan gedurende het ontwikkelingsproces van nieuwe geneesmiddelen.

Ter hoogte van de lever blijken echter ook talrijke carriers operationeel die bijdragen tot het transport van geneesmiddelen. Gedurende de laatste jaren werd hun bijdrage intensief onderzocht en zijn er talrijke nieuwe carriers ontdekt. Men is er zich meer en meer bewust van geworden dat de eliminatie van een geneesmiddel ter hoogte van de lever niet eenvoudig kan worden samengevat als het gevolg van de interactie met een welbepaald enzym, maar het gevolg is van een sequentieel verlopend proces waarbij specifieke mechanismen betrokken zijn: opname in de levercellen, interactie met het enzym en vervolgens efflux uit de levercellen. Waar men dacht dat opname en efflux louter passieve processen waren en dat de interactie met het enzym de snelheidsbepalende stap was, is men er zich nu bewust van geworden dat ook opname en efflux de snelheidsbepalende factoren kunnen zijn.

Carriers die de opname bevorderen zijn onder andere NTCP (Na-Taurocholate Cotransporting Polypeptide), OATP (Organic Anion Transporting Polypeptide), OAT (Organic Anion Transporter) en OCT (Organic Cation Transporter). Zowel geneesmiddelen als lichaamseigen stoffen (zoals galzouten, bilirubine, steroïdconjugaten) kunnen via die carriers worden opgenomen in de levercellen. Er kunnen verschillende vormen bestaan van dezelfde carrier. Zo werden er bijvoorbeeld voor OATP reeds elf vormen ontdekt, met als voornaamste OATP1A2, 1B1, 1B3 en 2B1. Hoewel deze een zekere overlap in substraatspecificiteit vertonen, bestaan er toch duidelijke verschillen in affiniteit. Naast die opnamecarriers bestaan er ook talrijke effluxcarriers die geneesmiddelen kunnen transporteren vanuit de levercellen naar het bloed of naar de galkanaaltjes. De voornaamste carriers die geneesmiddelen kunnen transporteren naar de galkanaaltjes zijn P-gp, BSEP (Bile Salt Export Pump), MRP2 en BCRP. Die carriers zorgen dus voor een versnelde eliminatie van geneesmiddelen via de gal. We moeten wel opmerken dat, nadat de gal in het darmkanaal is terechtgekomen, het geneesmiddel of de lichaamseigen stoffen opnieuw kunnen worden opgenomen (i.e. enterohepatische recirculatie). Ter hoogte van de basolaterale kant van de levercellen zijn de voornaamste carriers MRP1, 3, 4, 5 en 6.

Zoals vermeld kunnen al deze carriers een belangrijke invloed hebben op de farmacokinetiek, werkzaamheid en toxiciteit. Ook kunnen er belangrijke geneesmiddeleninteracties optreden ter hoogte van de carriers. Zo kan een geneesmiddel in competitie treden met een ander geneesmiddel of een voedingsstof voor transport via deze carrier. Als de carrier een beperkte capaciteit heeft, zal dit voor één van de twee aanleiding zijn tot verminderd transport. Gedurende het ontwikkelingsproces van nieuwe geneesmiddelen is het dan ook van belang na te gaan of een kandidaat-geneesmiddel eventueel substraat is van één van de vermelde carriers om het effect van mogelijke interacties met andere geneesmiddelen in te schatten. Voor het nagaan van die interacties bestaan er verschillende modellen die in het ontwikkelingsproces kunnen worden geïmplementeerd. Meestal wordt gebruikgemaakt van celgebaseerde modellen, zoals geïsoleerde levercellen of cellijnen van Xenopus laevis oöcyten waarbij de expressie van bepaalde carriers is verhoogd. Een bespreking van die verschillende modellen zou ons te ver leiden. We merken wel op dat in die systemen de typische polariteit van levercellen niet aanwezig is. Bij een recent ontwikkeld model – de sandwichcultuur – wordt de leverarchitectuur wel gedeeltelijk behouden. Hierbij worden levercellen in kweek gebracht tussen twee lagen collageen zodat de polariteit van de levercellen behouden blijft. Dit model laat toe om opname en efflux tegelijk te bestuderen.

Door de ontwikkeling van die verschillende modellen is men zich ervan bewust geworden dat carriers een belangrijke rol spelen bij klinisch significante geneesmiddeleninteracties. De interacties kunnen (net zoals bij enzymen) het gevolg zijn van zowel inhibitie als inductie (of een combinatie). Hierdoor kan de werkzaamheid van een geneesmiddel verminderen, of de kans op toxische verschijnselen vergroten. Als voorbeeld van geneesmiddelen die gevoelig zijn voor interferentie ter hoogte van opnamecarriers in de lever kunnen de cholesterolverlagende statines worden vermeld. Rosuvastatine is bijvoorbeeld een substraat van de carrier OATP1B1. Bij transplantatiepatiënten die tegelijk met cyclosporine behandeld worden, kan dit laatste leiden tot inhibitie van OATP, waardoor de opname van rosuvastatine in de levercellen daalt en de eliminatie uit het bloed daalt. Als gevolg van dergelijke gecombineerde medicatie werden er reeds tot zevenmaal hogere concentraties van rosuvastatine waargenomen, die natuurlijk kunnen leiden tot toxische neveneffecten.

Anderzijds zou het exploiteren van zulke geneesmiddeleninteracties kunnen leiden tot het toedienen van een lagere dosis van het actieve geneesmiddel (i.e. boosting). Het boostingprincipe wordt bijvoorbeeld reeds toegepast op het niveau van het metabolisme: ritonavir zorgt bijvoorbeeld voor een sterke inhibitie van cytochroom P450 3A4. Dit resulteert in een vermindering van de afbraak van geneesmiddelen die eveneens door dit enzym worden afgebroken (bijvoorbeeld HIV-proteaseremmers) waardoor hogere concentraties worden gegenereerd, wat het toedienen van een lagere dosis toelaat. Mogelijke carrier-gebaseerde boosting bevindt zich momenteel nog in een onderzoeksfase. Naast inhibitie van opnamecarriers kan inhibitie van effluxcarriers eveneens leiden tot klinisch significante geneesmiddeleninteracties. Zo zal de efflux (eliminatie naar de galkanaaltjes toe) van digoxine worden verhinderd door verapamil of ritonavir. Zeker voor een geneesmiddel waarbij er slechts een klein verschil is tussen de werkzame en de toxische concentratie moet men bedacht zijn op zulke interacties.

Ter hoogte van de carriers kunnen geneesmiddelen ook interfereren met de huishouding van lichaamseigen stoffen (bijvoorbeeld bilirubine, galzouten en thyroidhormonen). Een verstoring kan leiden tot matige of zeer ernstige neveneffecten. De galzouten illustreren dit. Het transport van galzouten vanuit het bloed naar de lever gebeurt via de opnamecarriers NTCP en OATP. Vervolgens worden de galzouten via de effluxcarrier BSEP in de galkanaaltjes uitgescheiden. Elk geneesmiddel dat interfereert met die carriers kan leiden tot een verhoogde intracellulaire accumulatie van galzouten in de lever (cholestasis) en verhoogde galzoutconcentraties in het bloed. Geneesmiddelen zoals cyclosporine A, rifampicine, rifamycine SV, bosentan, troglitazone en glyburide interageren met één of meerdere van de vermelde carriers en kunnen dus cholestasis veroorzaken. Screening voor mogelijke interactie met BSEP, OATP en NTCP gedurende het ontwikkelingsproces laat toe het effect van kandidaat-geneesmiddelen op galzoutconcentraties in het bloed en het potentieel tot het ontwikkelen van cholestasis te voorspellen.

Een zeer belangrijke bijdrage tot het identificeren en karakteriseren van die carriers ter hoogte van de dunne darm en de lever werd geleverd door de onderzoeksgroep van Les Benet, hoogleraar aan de University of California in San Francisco. Uit dit onderzoek vloeiden nieuwe inzichten voort in het synergistische effect van enzymen en carriers. De effluxcarriers zorgen er bijvoorbeeld voor dat de concentratie ter hoogte van het enzym laag genoeg blijft, zodat geen verzadiging optreedt. Efflux zorgt op die manier voor een gedoseerde aanvoer van substraat zodat de efficiëntie van het metabolisme geoptimaliseerd wordt. Naast de intestinale mucosa en de lever zijn er nog verschillende andere barrières waarbij carriers een belangrijke rol spelen, zoals bijvoorbeeld ter hoogte van de nieren. Ook een aantal organen die extra bescherming vereisen, worden omgeven door een specifieke barrière (placenta, bloed-hersenbarrière) waarbij specifieke carriers ervoor kunnen zorgen dat de passage van lichaamsvreemde stoffen en dus ook geneesmiddelen beperkt wordt.

Ook een aantal organen die extra bescherming vereisen, worden omgeven door een specifieke barrière

De ontwikkelde modellen voor die verschillende barrières hebben ons inzicht in de bijdrage van carriers tot het farmacokinetische profiel van geneesmiddelen sterk bevorderd. Er bestaat ook geen twijfel over dat de implementatie van die modellen gedurende het ontdekkingsproces een meer rationele selectie van kandidaat-geneesmiddelen mogelijk maakt. Een vroegtijdige identificatie van geringe absorptiemogelijkheden ter hoogte van de intestinale mucosa of interacties met enzymen en/of carriers ter hoogte van de intestinale mucosa en de lever, kan voorkomen dat een geneesmiddel in een late ontwikkelingsfase moet worden afgevoerd. Een verdere optimalisatie van de vermelde modellen dringt zich echter op. Belangrijke aandachtspunten zijn de zoektocht naar meer specifieke substraten van carriers om interacties met andere geneesmiddelen of lichaamseigen stoffen nog sneller te ontdekken, en een verdere verbetering van de biorelevantie van die testmodellen om de in-vivosituatie zo dicht mogelijk te benaderen.

De vermelde in-vitromodellen zijn zeer efficiënt en hebben reeds een belangrijke bijdrage geleverd tot een verbeterd selectieproces van kandidaat-geneesmiddelen. Dergelijke testen zijn echter nog vrij duur. Er is dan ook een nieuwe strekking om de vermelde processen te voorspellen via computersimulaties, een benadering die voorlopig nog in de kinderschoenen staat.

S. Shugarts en L. Benet, ‘The role of transporters in the pharmacokinetics of orally administered drugsr’, in: Pharmaceutical Research, 2009, 26 (9), 2039-54.

Patrick Augustijns is als onderzoeker biofarmacie verbonden aan de KU Leuven.