Deel dit artikel

door een stijgend en vaak ondoordacht gebruik van antibiotica zijn vele bacteriën ongevoelig of resistent geworden. antibioticaresistentie is wereldwijd een groeiend probleem en er is nood aan nieuwe geneesmiddelen. waar men in het verleden vooral naar nieuwe antibiotica zocht op basis van waarneembare eigenschappen, gebruikt men nu meer en meer nieuwe technieken die microbiële genomen kunnen ontrafelen op systeemniveau.

Zoeken naar nieuwe antibiotica

Jozef Anné en Kristel Bernaerts

Antibiotica zijn moleculen die door bacteriën of schimmels geproduceerd worden en die in staat zijn om bacteriën in hun groei te stuiten of zelfs te doden. Antibiotica werken door zich te binden aan een specifieke doelmolecule in een bacterie, waardoor een cellulaire functie die essentieel is voor het overleven van de bacterie wordt verhinderd. Sommige antibiotica kunnen ongewijzigd worden gebruikt als geneesmiddel, maar ze kunnen eventueel ook verder (bio)chemisch worden aangepast om hun activiteit te verhogen, resistentie te omzeilen of hun antibiotisch spectrum te verbreden. Zo kunnen ze actief zijn tegen meerdere soorten bacteriën, waardoor ze functioneler zijn in het lichaam.

Sedert de eerste klinische toepassing ongeveer zeventig jaar geleden hebben antibiotica ontelbare mensenlevens gered. Vele bacteriën zijn echter ongevoelig of resistent geworden tegen specifieke antibiotica, die dan ook niet langer in staat zijn hen te doden of hun groei af te remmen. Antibioticaresistentie is wereldwijd een toenemend probleem. Hiervoor zijn verschillende oorzaken: enerzijds worden antibiotica vaak overmatig en soms incorrect gebruikt, anderzijds is er de intrinsieke eigenschap van bacteriën om zich snel te vermenigvuldigen en zich genetisch gemakkelijk aan te passen, waarbij ze resistentie ontwikkelen. Door het groeiende aantal resistente bacteriën zijn vele antibiotica minder efficiënt geworden. De mogelijke gevolgen hiervan zijn dat mensen na een infectie langer ziek blijven en er bestaat zelfs een verhoogde kans op overlijden. Men schat dat in de Europese Unie jaarlijks ongeveer 25 000 patiënten overlijden als gevolg van infecties veroorzaakt door resistente bacteriën. Infecties met antibioticaresistente bacteriën hebben een kostenverhogend effect van naar schatting 1,5 miljard euro per jaar door toegenomen ziekenhuiskosten en langere arbeidsongeschiktheid.

In de Europese Unie overlijden jaarlijks ongeveer 25 000 patiënten als gevolg van infecties veroorzaakt door resistente bacteriën

Resistentie dook al snel op na de introductie van antibiotica. Zo werd reeds in de jaren 1960 in verschillende ziekenhuizen methicilline-resistente Staphylococcus aureus (MRSA) – nu gekend als de ziekenhuisbacterie – gerapporteerd. Terwijl in de beginfase relatief snel meerdere nieuwe antibiotica werden gevonden en in de klinische praktijk geïntroduceerd, werden de laatste twintig jaar geen nieuwe klassen van antibiotica voor klinische toepassingen meer op de markt gebracht. Wel werden in de strijd tegen deze resistente bacteriën voor meerdere antibiotica verschillende (bio)chemische aanpassingen uitgevoerd, waardoor ze toch nog konden worden bestreden.

Hoewel de beangstigende cijfers over antibioticaresistentie algemeen gekend zijn, is het aantal grote farmaceutische bedrijven dat nog investeert in het ontwikkelen van nieuwe antibiotica, zeer beperkt. Verwonderlijk is dit niet: het lange proces vanaf de zoektocht naar een nieuw antibioticum – vanaf de ontdekking tot aan de goedkeuring door het FDA (US Food and Drug Administration) en de industriële productie – neemt immers al snel meer dan tien jaar in beslag. De kostprijs voor de ontwikkeling van een geneesmiddel loopt vandaag op tot meer dan 1 miljard euro. Dit trage, dure en onzekere proces weerhoudt de meeste grote bedrijven dan ook om te investeren in dit type onderzoek. Omwille van de dringende problematiek van antibioticaresistentie heeft de Europese Commissie al in 2011 een actieplan opgesteld om verdere verspreiding van antibioticaresistente bacteriën tegen te gaan. Daarnaast wordt het onderzoek naar het vinden en ontwikkelen van nieuwe antibiotica gestimuleerd.
Waar in het verleden voornamelijk gebruik werd gemaakt van fenotypische analyses, dit wil zeggen op basis van direct waarneembare eigenschappen, wordt momenteel voornamelijk aandacht besteed aan nieuwe technieken die in staat zijn het hele DNA van micro-organismen (microbiële genomen) te doorzoeken op systeemniveau (de cel als een geheel). Wetenschappers kunnen vandaag steeds eenvoudiger de DNA-code van micro-organismen ontcijferen. Genoomsequentieanalyses en bio-informatica zijn de basiselementen voor de zogenaamde genoomgedreven ontdekking van nieuwe antibiotica.

Genoomsequentieanalyses en bio-informatica zijn de basiselementen voor de zogenaamde genoomgedreven ontdekking van nieuwe antibiotica

Decennialang is er naar antibiotica gezocht op basis van een waarneembare eigenschap, namelijk de vaststelling van de productie van een molecule door een micro-organisme, waardoor (onder laboratoriumcondities) een andere (ziekteverwekkende) bacterie wordt gedood of verhinderd wordt te groeien. De ontdekking van het eerste antibioticum was gebaseerd op zo’n, evenwel toevallige, waarneming. Op 3 september 1928 keerde Alexander Fleming – arts, microbioloog en hoogleraar in de bacteriologie aan het St. Mary’s Hospital in Londen – terug van vakantie en bekeek de plaatculturen van Staphylococcus aureus (Bacteriën die groeien op een vaste voedingsbodem worden plaatculturen genoemd.) Deze bacterie veroorzaakt onder andere steenpuisten, maar kan ook tot dodelijke infecties leiden. Fleming zag dat op één van deze plaatculturen een schimmel (Penicillium notatum) was gegroeid die de groei van de stafylokok verhinderde. Hij noemde de werkzame stof penicilline. Voor Howard Walter Florey en zijn collega Ernst Boris Chain aan de Universiteit van Oxford was Flemings waarneming in 1938 de aanzet tot onderzoek en karakterisering van de actieve stof. In 1940 slaagden ze er dan in om deze te isoleren en te identificeren. Pas vijftien jaar na Flemings waarneming werd de werkelijke waarde van penicilline als geneesmiddel herkend. Tijdens de Tweede Wereldoorlog werd de productie van penicilline op grote schaal ontwikkeld om gewonde soldaten en zieken te behandelen. Ook in Leuven werd tijdens de Tweede Wereldoorlog onderzoek verricht naar de productie van penicilline door de hoogleraren Pieter De Somer en Richard Bruynoghe in het Institut de Bactériologie. Het succes van de effectieve werking van penicilline was tegelijk de aanzet voor de speurtocht naar nieuwe antibioticaproducerende micro-organismen.

Van toen af werden micro-organismen van diverse oorsprong intensief geïsoleerd en gekweekt om hun effect op de groei en overleving van ziekteverwekkende bacteriën te onderzoeken. Voornamelijk stalen met veel organisch materiaal (bijvoorbeeld bosgrond of compost), waarin talrijke bodembacteriën aanwezig zijn, bleken een rijke bron van microbiële producenten van natuurlijke antibiotica. Een belangrijke groep bodembacteriën zijn de streptomyceten, die diverse antibacteriële moleculen aanmaken om zich te beschermen tegen de brede waaier aan competitieve micro-organismen in hun omgeving. Meer dan zestig procent van de gekende antibiotica is afkomstig van streptomyceten. Deze bacteriën produceren naast antibiotica ook andere bioactieve moleculen, zoals middelen tegen parasitaire rondwormen, bijvoorbeeld avermectine (ontdekt door William C. Campbell en Satoshi Omura, die de Nobelprijs voor Geneeskunde 2015 ontvingen), antitumorale of antivirale stoffen tot zelfs pesticiden en herbiciden. Vanaf de jaren 1940 gebeurde de zoektocht naar nieuwe antibiotica op basis van gerichte screening van geïsoleerde micro-organismen, voornamelijk bodembacteriën. Ze werden dan gekweekt onder verschillende groeicondities, en onderzocht naar hun vermogen om de groei van pathogene bacteriën te verhinderen. Bij positief resultaat werd de molecule geïsoleerd en gekarakteriseerd, en werd er getracht om de biosyntheseweg te identificeren.

Deze klassieke benadering is echter omslachtig, tijdrovend en het succes van een op waarneming gebaseerde ontdekking is niet altijd gegarandeerd. Als interessante moleculen slechts in zeer lage hoeveelheden voorkomen ten opzichte van een overmaat aan andere bioactieve moleculen is het moeilijk hen te herkennen en te identificeren. Een ander probleem stelt zich wanneer de synthese van een antibioticum niet aangeschakeld wordt onder laboratoriumcondities of wanneer de synthese zelfs nooit wordt aangeschakeld. Antibiotica hebben meestal een ingewikkelde structuur. Vertrekkend vanuit relatief eenvoudige moleculen in de cel worden ze gesynthetiseerd in een reeks van opeenvolgende biochemische reacties. Iedere reactiestap wordt uitgevoerd door een specifiek enzym (dit is het eiwit dat de biochemische reactie mogelijk maakt). De genetische informatie voor de aanmaak van die enzymen (eiwitten) zit vervat in het DNA, meer bepaald in de genen. De specifieke genen die coderen voor deze enzymen zijn gegroepeerd in clusters in het microbiële genoom. Bovendien gebeurt de vertaling van de genen tot actieve enzymen simultaan en gecontroleerd voor alle genen in de cluster. Antibioticaproducerende bacteriën beschikken meestal over meerdere biosynthesegenclusters. Elk van deze genclusters codeert voor een verschillend antibioticum met een aparte chemische structuur gevormd via een eigen biosyntheseweg. Daarnaast worden de genclusters niet allemaal tegelijkertijd geactiveerd, maar pas onder bepaalde omstandigheden. Antibiotica zijn zogenaamde secundaire metabolieten, ze zijn dus niet direct betrokken bij de groei maar ze kunnen een functie hebben in de overleving van de micro-organismen. Condities die aanleiding kunnen geven tot de expressie van antibiotica zijn bijvoorbeeld de uitputting van bepaalde nutriënten en de aanwezigheid van vreemde bacteriën. Biosynthese van antibiotica in laboratoriumcondities is daarom niet altijd gegarandeerd of mogelijk gezien de complexe groeiomgeving waarin sommige antibioticaproducerende stammen aanwezig zijn. Genclusters in het microbiële genoom die helemaal niet tot expressie komen, worden cryptische of stille genclusters genoemd.

De ontwikkeling van nieuwe antibiotica gebeurt via een computergebaseerde speurtocht naar biosynthesegenclusters in microbiële genomen

Om nieuwe antibiotica te ontdekken gebruikt men computergebaseerde (of in silico) methodes waarbij naar biosynthesegenclusters in microbiële genomen gezocht wordt. Dit is mogelijk geworden door de snelle technologische ontwikkelingen van de genoombepaling en bijbehorende bio-informatica. De eerste essentiële component in een genoomgedreven ontdekking van antibiotica is de beschikbaarheid van genoomsequenties. De sequentie van een genoom verwijst naar de volledige lettercode (A, T, G en C) van het DNA van een cel. Het DNA bestaat uit twee complementaire strengen die opgebouwd zijn uit vier elementaire bouwstenen, die voorgesteld worden door de letters A (adenine), T (thymine), G (guanine) en C (cytosine). De omvang van het DNA in één micro-organisme, of kortweg een microbieel genoom, varieert van ongeveer 0,5 tot meer dan 10 miljoen bouwstenen. Bepaalde sequenties van het DNA coderen voor eiwitten zoals enzymen, die bijvoorbeeld een rol spelen bij de biosynthese van een antibioticum. De stukjes DNA die coderen voor eiwitten zijn enkele honderden tot tienduizenden letters groot en men identificeert naargelang van de soort van minder dan 1 000, tot meer dan 10 000 genen in een bacterieel genoom.

Sinds de publicatie van de eerste bacteriële genoomsequenties in 1995 zijn nieuwe technieken ontwikkeld waardoor op dit moment snel, robuust, efficiënt en relatief goedkoop een genoomsequentiebepaling kan worden uitgevoerd. Grondige sequentiebepaling van een volledig bacterieel genoom kost vandaag ongeveer 200 dollar, wat meer dan duizendmaal goedkoper is dan tien jaar geleden. Niet alleen het genoom van een afzonderlijk organisme kan worden bepaald, maar ook metagenomen, wat een cocktail van DNA-sequenties is bekomen door genoomsequenties te bepalen op een mengsel van verschillende gekende en ongekende bacteriën die vaak geïsoleerd werden uit omgevingsstalen. In de periode van 2003 tot 2013 is het aantal volledige microbiële genoomsequenties in het NCBI (National Center of Biotechnology Information) vijfentwintig maal toegenomen tot 2 500 sequenties en in januari 2016 zijn er 4 381 bacteriële genomen en 177 schimmelgenomen gesequeneerd. Door de snelle en goedkopere DNA-sequentiebepaling van een veelheid stalen van diverse origine breidt de collectie van microbiële genomen en metagenomen voortdurend uit en vergroot het zoekgebied naar nieuwe bioactieve moleculen.

De tweede essentiële component in de genoomgedreven ontdekking zijn geautomatiseerde zoekalgoritmes uit de bio-informatica. Het is onbegonnen werk om zonder deze algoritmes op zoek te gaan naar interessante biosynthesegenclusters omdat die relatief klein zijn ten opzichte van het gehele microbiële genoom (10 000 baseparen tegenover enkele miljoenen baseparen in het hele genoom). Bio-informatica is een overkoepelende benaming voor rekenkundige technieken die biologische en/of biochemische informatie afleiden uit genoomsequenties. Een belangrijke stap in een genoomanalyse is het herkennen en benoemen van genen die coderen voor gekende eiwitten. Dit noemt men genoomannotatie. Genen bezitten enkele typische herkenningspunten. Ze bevatten een uniek startcodon (ATG) – een codon bestaat uit drie opeenvolgende basen – en één van de drie mogelijke stopcodons (TAG, TAA, TGA). Een start- en stopcodon flankeren een stukje DNA (of gen) dat codeert voor een eiwit. Een eiwit of proteïne bestaat uit een keten van aminozuren, die de eigenschap en functie van het eiwit bepaalt. In een gen kan men een opeenvolging van drielettercodons herkennen, die bepalen welk aminozuur er op een bepaalde plaats in de aminozuurketen moet komen. Het DNA van een gen dient dus als blueprint voor de synthese van een eiwit.

In silico of computergebaseerde herkenning van genen in een genoomsequentie gebeurt door te zoeken naar overeenkomsten met sequenties afgeleid van gekende eiwitten (beschikbaar in eiwitdatabanken). De aanwezigheid van genetische modificaties evenals de mogelijke variatie in codongebruik voor eenzelfde aminozuur (een aminozuur kan worden gecodeerd door meerdere codons) bemoeilijken de identificatie van de genen. Diverse softwarepakketten voor genoomannotatie combineren informatie uit DNA- en eiwitdatabanken. Nieuwe antibiotica kunnen worden gevonden door bijvoorbeeld te zoeken naar biosynthesegenclusters die gelijkenissen hebben met gekende clusters en/of door te zoeken naar eiwitten die typisch zijn voor antibioticabiosynthese. Een belangrijk voordeel van deze methode is dat zowel cryptische (stille) als actieve genclusters voor antibiotica worden ontdekt. Dit wordt geïllustreerd in genomen van bodembacteriën waar meer biosyntheseclusters ontdekt werden dan het aantal antibiotica dat gekend en uitgescheiden wordt in de omgeving. Streptomyces coelicolor bijvoorbeeld produceert drie antibiotica, maar daarnaast werden meer dan 29 biosyntheseclusters geïdentificeerd via in silico analyse. Tot slot wordt bij de zoektocht naar nieuwe antibiotica tegenwoordig ook zoveel mogelijk rekening gehouden met potentiële resistentie. Producten waartegen snel resistentie optreedt, zijn niet meer geschikt voor commercialisering of grootschalig gebruik.

Na identificatie van biosynthesegenclusters voor potentiële nieuwe antibiotica moet nog een reeks stappen worden uitgevoerd: de voorspelling van de exacte moleculaire structuur van het antibioticum, de bepaling van de fysicochemische en biochemische eigenschappen van het molecule en de isolatie, productie en kwaliteitscontrole van het gevormde antibioticum. In tegenstelling tot het ‘op goed geluk testen’ zoals gebeurde in het verleden, kan nu gericht de biosynthesegencluster worden geïsoleerd en tot expressie gebracht in een gastheercel (de zogenaamde recombinante expressie), kan een cryptische cluster tot expressie worden gebracht door het aanbrengen van een geschikte promotor, of kan de gekende gencluster (of delen ervan) worden verwijderd en deze mutanten opnieuw worden getest. Tot slot bevestigen experimenten met een ziekteverwekker en het nieuwe molecule de antibiotische werking.

De biodiversiteit is vele malen groter dan op dit moment gekend of onderzocht is. Eén gram bodem bevat miljoenen bacteriën. Men schat dat slechts 0,1 tot 10 procent van de totale microbiële populatie in de bodem kan worden gekweekt in het laboratorium. Een metagenomische benadering voor antibioticaontdekking is daarom zeker hoopvol. Slechts 1 procent van de actinomyceten, waartoe de streptomyceten behoren, werd reeds onderzocht. Niet alleen micro-organismen, maar ook planten en dieren zijn interessante bronnen van bioactieve moleculen met potentieel voor de medische sector. De toekomst van de ontdekking van nieuwe antibiotica ligt in een beter begrijpen van de natuur. Die is immers de beste, meest gesofisticeerde, veelzijdige en combinatorische chemicus.

Caitlin D. Deane en Douglas A. Mitchell, ‘Lessons learned from the transformation of natural product discovery to a genome-driven endeavour’, in: The Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, 2014, 41, 315-331.
János Bérdy, ‘Thoughts and facts about antibiotics: Where we are now and where we are heading’, in: The Journal of Antibiotics, 2012, 65, 385-395.

Kristel Bernaerts is als bio-ingenieur verbonden aan de KU Leuven.
Jozef Anné is als microbioloog verbonden aan de KU Leuven.

Deel dit artikel
Gerelateerde artikelen