proteomics lijkt het nieuwe toverwoord in het biomedisch onderzoek in vlaanderen te worden. nieuwe ontwikkelingen in dit domein maken het mogelijk om razendsnel honderden tot duizenden eiwitten te identificeren. eiwitten zijn de gangmakers in het metabolisme van de cel. door ze in kaart te brengen kan men veranderingen in de cel bestuderen. voor kankeronderzoek, waar het tijdig opsporen van tumoren essentieel is, zijn proteomics dan ook een grote sprong voorwaarts.
De eiwitfabriek in ons lichaam
Wat dan is het belang van proteomics? Als de code voor de eiwitten in de genen zit, levert een uitgebreide genomicsstudie dan niet voldoende informatie op om de bijhorende eiwitcatalogus perfect te voorspellen? Het antwoord op die vraag is nee. Veel eiwitten worden immers na hun productie (op basis van de code) nog gewijzigd, zodat ze in de cel aanwezig zijn onder verschillende vormen. Omdat eiwitten, en niet genen, de eigenlijke gangmakers van het metabolisme in de cel zijn, is het essentieel om eiwitten te bestuderen, willen we de diverse metabole processen echt begrijpen. Proteomics heeft als doel zoveel mogelijk eiwitten in kaart te brengen, en eventuele veranderingen in concentratie en structuur te detecteren.
Het is essentieel om eiwitten te bestuderen, willen we de diverse metabole processen echt begrijpen
Het domein van proteomics is vrij breed en het gaat te ver om alle mogelijke technologie die daarbij wordt gebruikt te bespreken of zelfs maar te vernoemen. Voor we kunnen ingaan op de nieuwste ontwikkeling in de eiwitidentificatie, de hogedoorvoerproteomics, is het belangrijk om drie wezenlijke begrippen uit te leggen uit de brede waaier van technieken waarmee proteïnepatronen kunnen worden bestudeerd: 2D-gelelektroforese, vloeistofchromatografie en massaspectrometrie.
In een gelelektroforese scheidt men eiwitten van elkaar door ze te laten bewegen in een gel onder invloed van een elektrische stroom. Elk eiwit zal met zijn eigen typische snelheid door zo’n gel migreren. In een tweedimensionale (2D) gelelektroforese wordt gebruikgemaakt van twee verschillende soorten fysische eigenschappen van eiwitten: het iso-elektrisch punt (pI) en het moleculegewicht (MG). Het iso-elektrisch punt is de zuurtegraad (pH) van de omgeving waarbij de nettolading van het eiwit nul is. Wanneer eiwitten onder invloed van een elektrische stroom migreren in een gelstrook waarin een pH-gradiënt bestaat, zal de migratie van elk eiwit stilvallen in de pH-zone die overeenkomt met de pI van dat eiwit. Daar is de nettolading van het eiwit immers nul en valt de kracht die de beweging drijft weg. Dat is de eerste dimensie. Vervolgens wordt de hele gelstrook op een tweede gel gemonteerd. Het tweede gel (de tweede dimensie) bestaat uit een matrix die eiwitten met een hoger moleculengewicht progressief sterker tegenhoudt: hier wordt dus een scheiding op basis van het moleculengewicht, zeg maar de grootte, verkregen.
Zo ontstaat er een patroon van spots dat kenmerkend is voor elk type cel, en dat het mogelijk maakt zowel fysiologische veranderingen van de cel (door bijvoorbeeld veroudering, stress ….) als niet-fysiologische veranderingen (door bijvoorbeeld mutaties of ziekte) te bestuderen. Met deze methode kunnen enkele honderden tot maximaal enkele duizenden eiwitspots van elkaar worden geïsoleerd.
Een bijzondere vorm is de 2D-DIGE (tweedimensionale Differentiële Gelelektroforese). In twee of maximaal drie stalen worden alle eiwitten gemerkt met telkens een andere fluorescerende kleurstof (bijvoorbeeld een groene voor staal 1, een rode voor staal 2). Vervolgens worden de stalen gelijktijdig op hetzelfde gel gebracht. Zo worden de verschillen tussen de stalen direct duidelijk. 2D gelelektroforese werd ontwikkeld in de tweede helft van de jaren zeventig. Het is zowat de oudste methode om veranderingen in eiwitexpressie op te sporen. Vanaf circa 1985 werd de methode gecombineerd met analysen van stukjes volgorde van de eiwitbouwstenen, vanaf de jaren 1990 met massaspectrometrie. Dat waren eigenlijk de eerste vormen van proteomics, hoewel het toen nog niet zo heette.
Migratie in een gel is niet de enige manier om eiwitten van elkaar te scheiden. Met vloeistofchromatografie, een methode met speciale scheidingskolommen, kan het ook. Eiwitten hechten zich vast op het materiaal waarmee die kolommen zijn gevuld, en door de verschillen in fysische en chemische eigenschappen van de eiwitten zijn ook de condities waarbij elk eiwit weer loskomt (de elutie) van de kolommen verschillend. Bij de elutie worden de eiwitten dus van elkaar gescheiden, en zo kan men ‘loslaatpatronen’ opstellen, die bruikbaar zijn om verschillen tussen twee of meer stalen op te sporen.
Met een massaspectrometer kan men de massa van een molecule bepalen. De massaspectrometer kan de massa meten van het totale eiwit, of de massa’s van de fragmenten die ontstaan wanneer het eiwit eerst in stukjes wordt geknipt met een speciaal enzyme (een protease), of tenslotte ook de massa’s van de kleine bouwsteentjes (aminozuren) waaruit elk eiwitfragment bestaat. De combinatie van al die gegevens levert een complex patroon van gemeten massa’s op, maar maakt het ook mogelijk de eiwitten daadwerkelijk te identificeren. In een massaspectrometer krijgen de moleculen eerst een elektrische lading: ze worden geïoniseerd. Vervolgens worden ze in een elektrisch veld geschoten en bereiken ze de analysator na een parcours dat afhangt van hun massa.
Het is eigenlijk pas met de komst van de twee ‘zachte’ ionisatietechnieken, namelijk MALDI (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionisation, beschreven in 1988 door Michael Karas en Franz Hillenkamp) en ESI (ElectroSpray Ionisation, beschreven in 1989 door John B. Fenn), dat massaspectrometrie (MS) ingang heeft gevonden als techniek om peptiden (kleine eiwitten) en eiwitten te bepalen. Op dit ogenblik worden niet minder dan vier verschillende analysatoren gebruikt voor proteomicstoepassingen van MS: een quadrupool, een TOF (Time-Of-Flight), een iontrap en ten slotte ook een FT-ICR (Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance, ook wel afgekort als FT). Van al deze analysatoren geeft FT-ICR de grootste nauwkeurigheid en hoogste resolutie. Een massa wordt hier gemeten met een afwijking van 1 ppm (parts per million) of minder. Een molecule met een massa van 100 dalton wordt dus met een nauwkeurigheid van 0,0001 dalton bepaald. Dankzij de ongeëvenaarde resolutie kunnen moleculen met bijna dezelfde massa toch van elkaar worden onderscheiden.
Voor massaspectrometers verschijnen er de laatste jaren zowat om de zes à twaalf maanden nieuwe systemen
De evolutie wat betreft de prestaties (snelheid, nauwkeurigheid, gevoeligheid, vermogen om twee moleculen met een bijna gelijke massa toch nog van elkaar te kunnen onderscheiden, besturingssoftware enzovoort) van een massaspectrometer is razendsnel en overtreft die van de PC. Een gemiddelde PC gaat drie tot vijf jaar mee voor hij verouderd is; voor massaspectrometers verschijnen er de laatste jaren zowat om de zes à twaalf maanden nieuwe systemen die de specificaties van voorgaande modellen in belangrijke mate overtreffen. Dat is niet zozeer te danken aan verbetering van bestaande toestellen, maar vooral ook aan de ontwikkeling van totaal nieuwe ‘hybride’ toestellen waarin eigenschappen van verschillende massaspectrometers met elkaar worden gecombineerd. Vooral de laatste vier jaar zijn de ontwikkelingen zo snel, dat specificaties die voor een bepaald toestel worden opgegeven maar enkele maanden geldig zijn, en er parallel al diverse toestellen worden aangeboden met een nieuwe functionaliteit. Zo ontstaan toestellen die zowel ESI- als MALDI-ionisatie kunnen uitvoeren, of toestellen waarbij verschillende analysatoren in lijn met elkaar geschakeld zijn, zoals een quadrupool-TOF, een quadrupool-IonTrap, een quadrupool-FT, een IonTrap-FT, een TOF-TOF.
Die technologische vernieuwing heeft de ontwikkeling ingezet van wat ‘hogedoorvoerproteomics‘ wordt genoemd. Daarmee wordt bedoeld dat honderden tot duizenden eiwitten kunnen worden geïdentificeerd in een relatief korte tijd, in enkele uren tot enkele dagen. Voor hogedoorvoeranalysen van eiwitten blijft identificatie via massaspectrometrie voorlopig nog de standaard. Hierbij kunnen verschillende toestellen worden ingezet. De Rolls-Royce van de MALDI-gebaseerde massaspectromtrie is op dit ogenblik een systeem met een tandem TOF-TOF-analysator. Zo’n toestel kan meer dan massa’s meten: het kan ook een molecule (peptide) selecteren en het netjes in stukjes knippen, zodat ook informatie over de volgorde van eiwitbouwstenen wordt verkregen. Deze extra informatie laat toe veel meer eiwitten te identificeren dan een apparaat met maar één TOF-analysator. Omdat MALDI-ionisatie beduidend minder problemen geeft met storende contaminaties dan ESI, is dit systeem zonder meer het beste voor de MS-analyse van eiwitspots uit bijvoorbeeld een 2D-gelelektroforese. Recente MALDI-TOF-TOF-toestellen, gekoppeld aan de nodige robotica voor staalvoorbereiding, kunnen tot vele duizenden analysen per vierentwintig uur uitvoeren: zoiets heet dus hoge doorvoer.
Een andere belangrijke recente ontwikkeling is de combinatie van een multidimensionale vloeistofchromatografie (MD-LC) met een massaspectrometer. In zijn meest elementaire vorm bestaat deze opstelling uit twee vloeistofchromatografische stappen, twee kolommen in serie geschakeld, zeg maar (2D-LC), gekoppeld aan een massaspectrometer (meestal een ESI-IonTraptoestel). De eiwitten krijgen een behandeling met een enzyme (een protease) dat ze in stukjes (peptiden) knipt voor ze op de 2D-LC geladen worden. Daardoor wordt een analyse on the fly door de massaspectrometer mogelijk, die direct aansluit op de chromatografische scheiding. De kracht van de techniek ligt in het indrukwekkende aantal eiwitidentificaties (vele honderden) per staal. Dat aantal kan zelfs nog worden opgedreven door technieken die de complexiteit van het staal, het peptidemengsel, te verminderen. Zo kan men alle peptiden isoleren die bepaalde minder frequent voorkomende bouwstenen (een cysteïne of een methionine) bevatten en uitsluitend die op het systeem laden. Of men kan van alle eiwitten slechts één peptide, afkomstig van één uiteinde, meenemen. Het meest in het oog springende nadeel van het systeem is dat het slechts één staal per dag kan analyseren (zij het buitengewoon grondig): de scheiding van het staal over de twee kolommen is een zeer tijdrovende aangelegenheid.
ESI- en MALDI-gebaseerde massaspectrometrie zijn bovendien complementair. Sommige eiwitten kunnen worden gemeten met beide ionisatiemethoden, andere zijn alleen aantoonbaar via MALDI, nog andere enkel via ESI. Een combinatie van beide geeft dus het hoogste aantal identificaties. Het is duidelijk dat hogedoorvoerproteomics een massieve datastroom genereert (een 2D-LC-MS bijvoorbeeld genereert al vlug vele tienduizenden spectra). Gelukkig heeft ook de bio-informatica een enorme evolutie ondergaan, zodat die datastroom beheersbaar blijft. Massaspectrometrie en bio-informatica zijn dus twee sleutelwoorden in hogedoorvoerproteomics. Drie voorbeelden zullen dat duidelijk maken.
Profielstudies (Profiling), Biomerkers en Differentiële Proteomics, Klinische Proteomics zijn verschillende benamingen voor wat in wezen dezelfde strategie is. In al die gevallen spoort men eerst op welke moleculen een biologisch relevant verschil in expressie vertonen, en pas daarna zal men die moleculen identificeren en karakteriseren. Op die manier gaat er geen tijd verloren met de productie van allerhande ‘nutteloze’ data. Deze strategie is vooral populair in het kankeronderzoek. Voor de opsporing van tumoren is het erg belangrijk te beschikken over een goede biomerker (een tumor marker), want hier geldt het axioma dat hoe vroeger de behandeling kan starten, hoe groter de kans op volledig herstel is. Allerhande vormen van hogedoorvoerproteomics worden daarbij gebruikt. Het menselijke oog is niet meer bij machte om de verschillen te vinden in zulke complexe data. Maar ook op dit gebied is de bio-informatica in volle ontwikkeling en wordt spitstechnologie aangewend om relevante verschillen op te sporen (bijvoorbeeld decision tree, wavelet compressie, spotfire ….).
Multiplexing is een andere opmerkelijke en zeer recente techniek, die gebruikmaakt van een complexe technologie om stalen te labelen. Alle peptiden afkomstig uit een staal krijgen een tag die uit drie stukken bestaat: (1) een stuk dat zorgt voor binding aan één uiteinde en aan alle lysinebouwstenen van het peptide, (2) een stuk met een massa van 31 dalton en (3) een stuk met een massa van 114 dalton. Er bestaan nog drie andere tags met dezelfde opbouw maar waarvan de massa van stuk twee en stuk drie respectievelijk 30+115, 29+116 en 28+117 bedraagt. De totale massa van elke tag is dus gelijk, alleen de massa van de deelstukjes verschilt. Op die manier kan men maximaal vier stalen van een eigen label voorzien en met elkaar mengen. De massaspectrometer zal het verschil zien: na fragmentatie ontstaat er voor elk peptide een eigen 114-115-116-117-patroon met gelijke of met verschillende intensiteiten, naargelang dit peptide in de verschillende stalen al dan niet in dezelfde concentratie aanwezig was.
Eiwitten werken samen zoals in de automobielindustrie verschillende ploegen samen uiteindelijk de constructie van een auto realiseren
Het Interactoom is de derde oom van de familie. Proteomics brengt continu in kaart hoe alle eiwitten samen (al dan niet in wisselende mate) veranderen. Dat genereert ook een nieuw soort informatie die kan bijdragen tot het opstellen van het interactoom: de kaart van alle verschillende interacties tussen eiwitten. Sommige arbeiders blijven geassocieerd in éénzelfde ploeg, andere daarentegen lijken een rol te spelen in meerdere ploegen. De grote kracht van het interactoom is dat men inzicht krijgt in de samenstelling van de verschillende ploegen eiwitten, dat identificatie van één of meerdere eiwitten van dezelfde ploeg al een hint kan geven over wat er aan de hand is, en vooral dat uit het interactiepatroon van een eiwit zijn uiteindelijke functie in de cel verduidelijkt wordt. Bio-informatica maakt het mogelijk na te gaan in hoeverre bepaalde eiwitten in de verschillende proteoomkaarten samen op eenzelfde wijze veranderen (toenemen of afnemen in concentratie).
In Vlaanderen zijn de universiteiten begonnen met de oprichting van centra voor echte hogedoorvoerproteomics. Aan de K.U.Leuven is men, dank zij impulsfinanciering en het Fonds Minister Van Mechelen, nog een stap verder gegaan en wordt met de oprichting van het Interfacultair centrum voor Proteomics en Metabolomics (ProMeta), spitstechnologie voor hogedoorvoerproteoomanalysen én voor metaboloomanalysen én voor bio-informatica in één centrum samengebracht. In het centrum zijn kerngroepen uit vijf verschillende faculteiten (Geneeskunde, Farmaceutische Wetenschappen, Bio-ingenieurswetenschappen, Wetenschappen, Toegepaste Wetenschappen) verankerd. Het centrum wordt uitgerust met zowel MALDI-TOF-TOF-MS, 2D-LC-MS als FT-MS, met kruisbestuiving van de diverse technologieën als gevolg. Hierdoor ontstaat een unit die een eerste stap kan zetten in de richting van totaalspectrumanalysen: studies die niet alleen aan het licht brengen welke eiwitten aanwezig zijn (proteomics) maar ook wat zij doen (metabolomics: de studie van de metabolieten die door de eiwitten geproduceerd worden).
S. Ghaemmaghami e.a., ‘Global analysis of protein expression in yeast’, in: Nature 425, 737-741.
W.K. Huh e.a., ‘Global analysis of protein localization in budding yeast’, in: Nature 425, 686-691.
Etienne Waelkens is als biochemicus verbonden aan de KU Leuven.
This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Unported License