de laatste decennia is de kennis van de genen en de genproducten die betrokken zijn bij het ontstaan van een primaire tumor ontzettend toegenomen. de kennis over de metastasegenen –genen die verband houden met de uitzaaiing van de kanker – is echter nog beperkt. toch zijn het net uitzaaiingen die kanker vaak ongeneeslijk maken. het is dan ook van belang het complexe proces van metastasering stap voor stap te analyseren.
De moleculaire basis van kankeruitzaaiing
Kankeruitzaaiing of metastasering maakt kanker doorgaans tot een ongeneeslijke ziekte en is verantwoordelijk voor de meeste gevallen van therapeutisch falen. Goedaardige tumoren, zoals adenoma’s en papilloma’s, groeien lokaal en doorbreken in principe de basaalmembraan niet. Die bestaat uit een dunne maar stevige laag van gespecialiseerde eiwitten en proteoglycanen en omringt de meeste normale weefsels. Tumoren worden kwaadaardig als ze hun originele locatie, meestal op een actieve manier, verlaten. Bij de mens zijn tot negentig procent van de tumoren afgeleid van epitheelweefsels, die het lichaamsoppervlak (huid, slijmvliezen) en de inwendige holten van de organen (klieren, longen, darmstelsel) bedekken. Die kwaadaardige epitheliale tumoren noemt men kankers of carcinoma’s. Kankeruitzaaiing kent een meerstappenproces dat uiteindelijk leidt tot het ontstaan van secundaire (tertiaire, …) tumoren op plaatsen in het lichaam die gescheiden zijn van die waar de originele tumor is ontstaan. Cellen van de primaire tumor kunnen langs twee wegen uitzaaien: via bloedvaten of via lymfevaten. Dit proces van metastasering is uiterst complex omdat tal van macromoleculen erbij betrokken zijn en tal van verschillende celtypes en celcondities stapsgewijze meespelen. In de laatste decennia is onze kennis van de genen en genproducten die door hun activering of inactivering betrokken zijn bij het ontstaan van de primaire tumor er beduidend op vooruitgegaan. De kennis over de zogenaamde metastasegenen is echter nog vrij beperkt. Welke soort genen zou nu naar verwachting een rol kunnen spelen in uitzaaiingsprocessen? Het is belangrijk de diverse stappen in dit complexe biologische systeem diepgaand te analyseren. Ik zal dit eerst vanuit een klassieke invalshoek doen om dan een aantal stappen opnieuw te behandelen in de context van recente experimenten en hypothesen.
Dikkedarmtumoren zaaien bij voorkeur uit naar de lever
Voor elk van die stappen bestaan specifieke tests die toelaten om tumorcellen met lage versus hoge efficiëntie te identificeren en met elkaar te vergelijken, zowel fenotypisch als genotypisch. Zo werd reeds aangetoond dat defecten in de expressie van E-cadherine, een universele intercellulaire adhesiemolecule voor epitheliale cellen, aan de bron liggen van het metastatische vermogen van vele carcinomen. Daarnaast konden migratorische en invasieve karakteristieken mee worden toegeschreven aan eigenschappen zoals de expressie van diverse metalloproteasen en chemokinereceptoren. Metalloproteasen staan in voor de afbraak van onder andere de basaalmembraan. Chemokinereceptoren reageren op specifieke moleculen, chemokines, die cellen actief aantrekken. Een interessante wending bij dit onderzoek was de ontdekking van complementaire chemokine-expressie in doelwitorganen zoals het bot. Die biedt een moleculaire verklaring voor de reeds lang geobserveerde orgaanspecificiteit van uitzaaiende tumoren. Dikkedarmtumoren zaaien bij voorkeur uit naar de lever. Dit kan deels worden verklaard door de vasculaire anatomie van het orgaan met de primaire tumor: het eerste capillair bed of lymfeknoop waar de circulerende darmkankercellen vertragen en waar een verhoogde kans is op extravasatie en kolonievorming, ligt in de lever. Toch had men in eerdere metastase-experimenten, zoals die van Isaiah Fidler, tumorcellen van eenzelfde herkomst (borsttumor- of melanomacellen) kunnen subkloneren in klonen met een specifieke uitzaaiingsvoorkeur, zoals long-, hersen- of botzoekende tumorcellen. Dit kon gedeeltelijk worden verklaard op basis van orgaanspecifieke aantrekkings- en herkenningsmoleculen. Men had dus een moleculaire verklaring voor de zogenaamde ‘Seed and Soil’-hypothese, die Stephen Paget reeds in 1889 formuleerde.
Niettemin bleven vele vragen onopgelost. Zo kwam er steeds meer evidentie dat uitgezaaide tumorcellen weken tot jaren ‘slapend’ kunnen blijven, voor ze effectief uitgroeien tot detecteerbare en gevaarlijke metastasen. Dit fenomeen is bij terugval van menselijke kankerpatiënten welbekend, maar kan omwille van de trage evolutie en lage frequentie ervan moeilijk worden bestudeerd. Anderzijds was het ook merkwaardig dat metastasen goed gedifferentieerde tumorcellen kunnen omvatten met sterke E-cadherine-expressie, terwijl invasieve carcinomacellen juist gekenmerkt zijn door E-cadherine-onderdrukking. Die paradox kreeg een aanneembare verklaring door het concept van epitheliale-mesenchymale transitie of EMT. Dit is een volmaakt natuurlijk proces dat onder meer tijdens de vroege embryonale ontwikkeling een belangrijke rol speelt. EMT staat bijvoorbeeld in voor de vorming van andersoortige weefsels uit de primitieve huid: hersenen en het ruggenmerg, de spieren of kraakbeen en been. Het houdt in dat cellen in epitheelweefsels een aantal typische kenmerken, zoals de expressie van E-cadherine, verliezen, terwijl ze in de plaats daarvan kenmerken verwerven die typisch zijn voor niet-epitheliale cellen zoals neurale cellen of bindweefselcellen. EMT speelt echter ook een belangrijke rol in progressie van kanker. Meerdere onderzoeksgroepen ontdekten dat diverse controle-eiwitten (onder andere ZEB1 en 2, Snail, Twist), waarvan geweten was dat ze EMT-processen in het embryo bewerkstelligen, verhoogd kunnen voorkomen in invasieve tumoren en daar verantwoordelijk zijn voor processen zoals onderdrukking van E-cadherine en inductie van cellulaire migratie. Die controle-eiwitten reguleren transcriptie, het proces waarbij DNA wordt omgezet in boodschapper-RNA, dat op zijn beurt in het translatieproces omgezet wordt in eiwit. Het interessante van transcriptieregulatie is dat die, in tegenstelling tot irreversibele DNA-mutaties, vlot kan worden aan- en uitgeschakeld in functie van bijvoorbeeld een wisselende samenstelling van de weefsels. In de context van EMT en kanker betekent dit dat transcriptiefactoren ervoor kunnen zorgen dat de bindingen tussen epitheliale cellen eerst losgelaten worden, zodat zij zich vrijer kunnen verplaatsen van de primaire tumor naar een ectopische locatie, en dat die typisch epitheliale bindingen zich vervolgens in de secundaire tumor opnieuw kunnen vormen. Anderzijds zou die reversibiliteit van het EMT-proces ook mogelijkheden kunnen openen voor innovatieve antikankertherapie.
Wanneer, waar en waarom echter zijn dergelijke transcriptionele repressoren actief? Een belangrijke rol is weggelegd voor natuurlijke, niet-coderende RNA-moleculen, waarvoor recent meerdere onderzoeksgroepen wereldwijd sterke evidentie vonden dat ze de transcriptionele repressoren ZEB1 en ZEB2 reguleren, die op hun beurt de aanmaak van E-cadherine onderdrukken. Tot die niet-coderende RNA’s behoren NAT’s, of Natural Antisense Transcripts. Genen bestaan uit dubbelstrengig DNA, waarvan de sense streng codeert voor eiwit en dus wordt afgeschreven in senseboodschapper-RNA. Als nu ook de andere streng wordt omgezet in RNA, wat veel minder frequent gebeurt, dan zal dit antisense-RNA een complex aangaan (hybridiseren) met het sense-RNA, en het zo gevormde dubbelstrengige RNA zal doorgaans minder efficiënt zijn in het translatieproces waarbij eiwitten worden aangemaakt. Tot tien procent van de menselijke genen codeert voor NAT’s, die dus vaak geassocieerd zijn met verminderde expressie van deze genen. Een Spaanse groep kwam nu tot de merkwaardige vaststelling dat het ZEB2-gen codeert voor een NAT, maar in dit geval resulteert de aanmaak van het NAT niet in een verminderde maar in een verhoogde translatie van ZEB2-eiwit, en bijgevolg in nog meer verminderde E-cadherine-specifieke transcriptie, wat ten slotte leidt tot meer EMT. Dit alles intrigeert des te meer omdat Snail, een andere transcriptionele repressor, de expressie van het ZEB2-NAT bleek te induceren, waardoor EMT dus extra sterk wordt aangezwengeld. Dit is slechts één voorbeeld van de uitvoerige interacties die blijken te bestaan tussen de verschillende EMT-inducerende regulatoren.
Daarnaast bleek ook een belangrijke rol weggelegd voor micro-RNA’s (miRNA’s). Dit zijn korte RNA-moleculen, die zelf niet coderen voor eiwitten, maar wel specifiek interageren met meestal meerdere boodschapper-RNA’s en daardoor de translatie van eiwitten op deze groep van boodschapper-RNA’s remmen. In het menselijke genoom werden tot dusver zo’n 700 miRNA’s geïdentificeerd. Vooral voor de miR-200 familie van miRNA’s ontdekte men dat interferentie optreedt met de aanmaak van zowel ZEB1 als ZEB2. Enerzijds bleek de expressie van die miR-200 RNA’s onder andere in borsttumoren gecorreleerd te zijn met behoud van een meer gedifferentieerd epitheliaal fenotype, terwijl anderzijds deze miRNA’s verdwijnen in het sterk agressieve basale type van borstkanker. Fijnregeling van EMT tijdens de embryonale ontwikkeling, maar evenzeer tijdens tumorale invasie, is dus uiterst belangrijk, zoals blijkt uit de complexe regulatie van EMT via die miRNA’s. Expressie van ZEB-eiwitten remt immers de aanmaak van die miRNA’s, die op hun beurt de aanmaak van de ZEB’s remmen. Er bestaat dus een delicaat evenwicht tussen de verschillende regulatoren van het EMT-proces. Daarnaast is er de EMT-inducerende factor TGF-β, die zelf een doelwit is voor die miRNA’s maar de aanmaak ervan tegenwerkt door opregulatie van ZEB-eiwitten, wat leidt tot onderdrukking van het epitheliale fenotype. In bepaalde celtypes wordt het mesenchymale fenotype dan extra gestabiliseerd doordat de cellen zelf TGF-β gaan aanmaken, wat een autocrien signalisatie-effect veroorzaakt. Autocrien verwijst naar de productie van signaliserende moleculen door een cel, die er vervolgens zelf op reageert. Zulke regulaties kunnen extra actief zijn ter hoogte van het zogenaamde ‘invasieve front’ van tumoren, waar stromale cellen, zelf niet-tumorigeen maar wel geactiveerd door de naburige tumor, beduidend kunnen bijdragen tot een invasie-stimulerende micro-omgeving.
De voornaamste metastasehypothese, die bijna een klassieke status kreeg, was die van de selection of the fittest, volgens Charles Darwins gedachtegoed. In de originele tumorcellen zou geleidelijk een accumulatie van genetische of epigenetische wijzigingen gebeuren en in functie van de progressie doorheen het meerstappenproces van kankeruitzaaiing worden dan telkens andere subpopulaties geselecteerd. Terwijl bij elke stap, waaronder invasie, intravasatie, extravasatie en kolonievorming, de grote overmaat van de cellen in de populatie inactief, geremd of zelfs geëlimineerd wordt, zou een minderheid van de kankercellen wél het meest geschikt zijn voor die bepaalde stap. Overleving is telkens belangrijker dan sterke proliferatie, hoewel een groter aantal cellen natuurlijk de kansen op de ontwikkeling van een significante pathologie verhogen. Een meer recente variant op dit ‘evolutieve’ model is de toegevoegde rol van de micro-omgeving. Een cel in het originele weefsel, of na doorbraak van de basaalmembraan, of in een bloed- of lymfevat, of ten slotte in een ‘vreemd’ orgaan, zal telkens andere effecten ondergaan van de extracellulaire matrix en van residente cellen in de nieuwe omgeving. Die effecten zijn dan paracrien (op basis van moleculaire signalen afkomstig van cellen in de directe omgeving) of juxtacrien (door signalen gebaseerd op directe contacten tussen cellen) in tegenstelling tot bijvoorbeeld endocriene effecten (door moleculaire signalen getransporteerd door de bloedbaan). Anderzijds zal er zowel in de primaire als in de uitgezaaide tumoren een variërende invloed zijn van infiltrerende cellen zoals witte bloedcellen en diverse types van geactiveerde bindweefselcellen. Het idee wint bovendien steeds meer veld dat infiltraties van inflammatoire cellen de tumorprogressie eerder stimuleren dan afremmen. Dit alles impliceert dat een subpopulatie van tumorcellen kan evolueren tot geringere aanpassing aan de originele micro-omgeving, maar anderzijds beter kan overleven tijdens metastasering of beter kan prolifereren in het gekoloniseerde orgaan. Recente bevindingen doen ons echter twijfelen aan het survival of the fittest-model voor selectie van metastastische tumorcellen. Het is haast ironisch dat tweehonderd jaar na de geboorte van Darwin en honderdvijftig jaar na publicatie van de ‘Origin of the species’ de extrapolatie van zijn evolutietheorie naar het metastaseonderzoek min of meer wordt aangevochten. Dit doet natuurlijk niets af aan de geldigheid van zijn theorie met betrekking tot de oorsprong der species.
Recente bevindingen doen ons twijfelen aan het survival of the fittest-model voor selectie van metastastische tumorcellen
De bevindingen die het survivalmodel in vraag stellen zijn de volgende. Enerzijds bleek dat eiwitten die invasie of EMT verhinderen (belangrijk voor uitzaaiing), ook een remmende invloed hebben op celproliferatie (ook belangrijk voor de primaire tumor). Anderzijds werd voor het EMT-inducerende Twist-eiwit recent een rol vooropgesteld bij inhibitie van cellulaire senescentie. Dit is een belangrijke vereiste bij het verwerven van tumorigeniciteit, ook op de primaire locatie. Cellulaire senescentie is immers het proces dat op nagenoeg irreversibele wijze de celdeling blokkeert in geval van stresssituaties, zoals die effectief ontstaan bij activering van oncogenen en inactivering van tumorsuppressorgenen. Samen met de ontwikkeling van een uitgebreid tumorvatstelsel geldt blokkering van senescentie dan ook als een primordiale stap bij de uitgroei van microletsels tot effectief bedreigende gezwellen, zowel in de primaire tumor als in metastasen. Het feit dat eenzelfde Twist-eiwit zowel kan instaan voor inhibitie van senescentie als voor inductie van EMT maakt de grens tussen oncogenen en metastasegenen sowieso wat artificiëler. Daarbij komt de groeiende perceptie dat de verschillen tussen tumorcellen in de primaire tumor en die in uitzaaiingen eigenlijk al bij al niet zo groot zijn als men zou kunnen verwachten bij een selection of the fittest-model. Zo heeft recent onderzoek van Christoph Klein en collega’s (Regensburg) op zowel proefdiermodellen als borstkankerpatiënten, uitgewezen dat metachrone metastasen die gedurende maanden tot jaren latent zijn, reeds uitgezaaid kunnen zijn in heel vroege stadia, wanneer de primaire tumor ogenschijnlijk nog strikt gelokaliseerd is en uit cellen bestaat die amper chromosomale defecten blijken te hebben. De latere activiteit van ‘metastasegenen’ zou zich dan eerder beperken tot de doorbreking van de latentietoestand, een wekscenario dus, dan tot de inductie van invasie- en migratiecapaciteit.
Beslissende gebeurtenissen met betrekking tot agressiviteit en metastatisch vermogen van tumorcellen kunnen effectief reeds in een vroeg stadium van tumorontwikkeling plaatsvinden. Dit blijkt ook uit twee recente belangwekkende studies. Enerzijds genereerde een onderzoeksgroep van Genentech Inc. (California) een antilichaam dat specifiek gericht is tegen neuropiline-2, dat in lymfatische endotheelcellen fungeert als (co-)receptor voor VEGF-C (vascular endothelial growth factor C). Die groeifactor-receptorcombinatie bleek zeer specifiek te zijn voor tumorale lymfangiogenese, met andere woorden het ontstaan van een functioneel lymfatisch systeem in de zich ontwikkelende tumor. Het door Genentech ontwikkelde antilichaam bleek dit proces te remmen ter hoogte van de primaire tumor en leidde tot significante reductie van metastasering via het lymfatische systeem. Anderzijds onderzocht de groep van Terumi Kohwi-Shigematsu (University of California) het nucleaire eiwit SATB1, waarvoor een genomische organisatorrol bekend was. In borstkankercellen kon SATB1 de expressie van meer dan duizend genen moduleren, waaronder tal van genen die vroeger reeds werden geassocieerd met metastasering. Experimentele depletie van SATB1 in hoogmetastatische kankercellen verminderde zowel primaire tumorgroei als metastasevorming, terwijl geforceerde expressie van SATB1 zowel primaire tumorgroei, invasie als metastasevorming verhoogde. Reeds in vroege klinische stadia van borsttumoren blijkt SATB1-expressie indicatief zijn voor een slechte prognose. Het is evident dat SATB1 een interessant kandidaat-doelwit is voor innovatieve therapie gericht tegen metastatische borstkanker.
Kankerstamcellen zouden niet zozeer gemuteerd zijn dan wel de eigenschappen behouden van normale stamcellen
Dit brengt ons ten slotte bij de vrij controversiële kankerstamceltheorie, die een alternatief biedt voor de mutatiegedreven klonale expansietheorie. Die laatste neemt aan dat de heterogene populatie van gemuteerde cellen in carcinoma’s een progressie naar hogere maligniteit doormaakt op basis van continue selectie van best-fitting gemuteerde klonen in interactie met de micro-omgeving. Kankerstamcellen daarentegen zouden niet zozeer gemuteerd zijn dan wel de eigenschappen behouden van normale stamcellen: zelfvernieuwende doch asymmetrische celdelingen met vorming van enerzijds een dochterstamcel en anderzijds een cel die kan differentiëren, eventueel ontaarden, in de uiteenlopende celtypes die in kankers worden aangetroffen. In tegenstelling tot een normale stamcel zal een kankerstamcel in staat zijn om tumoren te initiëren, ook al maken ze maar een kleine subfractie uit van het totaal aantal cellen in tumoren. Typerend voor kankerstamcellen is ook de expressie van merkers die men normaliter in immature celtypes aantreft. Dergelijke stamcelmerkers zijn bijvoorbeeld hoog CD44 en/of hoog CD133, eventueel in combinatie met laag CD24. Volgens de mening van ervaren kanker(stam)celkenners zoals Kornelia Polyak (Boston, USA) en Jan Paul Medema (AMC, Amsterdam) ligt de waarheid voor vele kankers wellicht in het midden: genetisch onstabiele kankercellen kunnen blijkbaar ook op hoogplastische wijze evolueren naar een kankerstamcelfenotype mits, al dan niet op stochastische wijze, een passende cocktail van transcriptiefactoren wordt geactiveerd. Uit een merkwaardige studie door de groep van Bob Weinberg (Cambridge, USA) bleek dat normale of tumorale borstkliercellen met stamcelkarakteristieken (hoge CD44- naast lage CD24-waarden) ook typische EMT-merkers uitdrukken, zoals verhoogde expressie van ZEB2, Twist en Snail, in associatie met verminderd E-cadherine en verhoogd vimentine. Anderzijds bleek de conditionele inductie van de EMT-inducerende transcriptiefactoren Twist en Snail in geïmmortaliseerde borstkliercellen van mens of muis te leiden tot inductie van stamcelmerkers en een verhoogd kankerinitiatiepotentieel. Als men uitgaat van het concept dat EMT ook invasie en metastasering in de hand werkt, dan moet men concluderen dat cellen met stamcelkarakteristieken in bepaalde primaire tumoren niet alleen de tumorale groei bewerkstelligen maar ook de drijvende factor uitmaken bij progressie tot kwaadaardige uitzaaiende kankercellen. Dit heeft alleszins consequenties voor therapeutische efficiëntie, aangezien die kankerstamcellen vrij resistent blijken te zijn tegen klassieke benaderingen van chemo- en radiotherapie, terwijl ze anderzijds toch kunnen worden beschouwd als de doelwitcellen bij uitstek. Overigens, het feit dat resistente kankerstamcelklonen uitgroeien bij therapie houdt in dat voor een goed begrip van kankers het best een integratie wordt gemaakt van de kankerstamceltheorie met de mutatiegedreven klonale expansietheorie.
A. Chung, ‘Molecular Medicine Select’, in: Cell, 2008, 133, 383-385.
C. A. Klein, ‘The Metastasis Cascade’, in: Science, 2008, 321, 1785-1787.
L. Vermeulen, M.R. Sprick, K. Kemper, G. Stassi, J.P. Medema, ‘Cancer stem cells – old concepts, new insights’, in: Cell Death and Differentiation, 2008, 15, 947-958.
R. A. Weinberg, ‘Twisted epithelial-mesenchymal transition blocks senescence’, in: Nature Cell Biology, 2008, 10, 1021-1023.
Frans van Roy is als moleculaire celbioloog verbonden aan de Universiteit Gent en het VIB.
This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Unported License