eiwitten zijn de machines van de biologie. nu van meer dan 50.000 eiwitten de moleculaire structuur gekend is, dringt de vraag zich op naar de werking van die moleculen. Wat doen ze en vooral hoe doen ze het? een antwoord ligt niet meteen voor het grijpen. het is daarom nodig moleculaire machines in actie te bestuderen. niet alleen kennis van hun structuur is belangrijk, maar ook kennis van de dynamische eigenschappen.
Moleculaire machines in actie
Biomoleculen worden gegroepeerd in chemische families, zoals nucleïnezuren, lipiden, koolhydraten en eiwitten. Ook hun biologische functies zijn daaraan gekoppeld. Nucleïnezuren zorgen voor opslag van erfelijke informatie, lipiden en fosfolipiden vormen de grenslagen of membranen. Lipiden en suikers zijn ook energiebronnen. De eiwitten ten slotte zijn de werkpaarden, de machines van de biologie. Daarnaast zijn er natuurlijk ook moleculen nodig om uitgebreide structuren op te bouwen. Intussen kennen we de structuur van reeds meer dan 50.000 eiwitten. Eén voor één werden ze afgezonderd en gezuiverd en hun structuur werd bepaald door een x-stralenanalyse van hun kristallen of in oplossing door Nucleair Magnetische Resonantie (NMR). Van elk van die eiwitten zijn de relatieve posities van de atomen opgeslagen in de Protein Data Bank en hun moleculaire structuur kan zichtbaar worden gemaakt op een computerscherm, miljoenen malen vergroot. De allereerste structuur werd rond 1960 bepaald door John Kendrew en Max Perutz. Ondertussen is ook al het volledige genoom van tientallen levende wezens gekend, dit wil zeggen de exacte nucleotidevolgorde van alle genen van een aantal levende wezens, waaronder enkele eencelligen, enkele planten, een worm, een man en binnenkort ook een vrouw. Het gaat hier over de nucleotidevolgorde van miljarden eenheden.
Een eerste manier om de moleculaire machines in actie te zien is te kijken naar hun activiteit zelf. Voor een enzym bijvoorbeeld is dit de omzetting van het substraat naar het product. Dankzij de chemici zijn er heel wat artificiële substraten voorradig waarvan de omzetting zichtbaar is, bijvoorbeeld door een kleurverandering of door het verschijnen van een licht(fluorescentie)signaal. Op die manier kunnen we vaststellen welke enzymen zeer actief zijn en welke minder, en dat zelfs binnen in een levende cel. Maar zelfs als we weten ‘wat’ al die moleculen doen en ‘waar’ ze dit doen, dan rest nog altijd de intrigerende vraag ‘hoe’ ze het doen. We willen dus ook begrijpen wat er binnen in die moleculaire machines gebeurt. En dit blijkt een moeilijke vraag te zijn.
De moderne lichtmicroscopie heeft een enorme ontwikkeling gekend en is zo gevoelig geworden dat ze toelaat om individuele moleculen te zien. Biedt dit een mogelijkheid om moleculaire machines in actie te zien? Ja, wanneer men naar de activiteit kijkt van één enzymmolecule dat men vasthecht aan een glazen plaatje en daar voortdurend in het oog houdt met de hulp van een fluorescentiemicroscoop. Telkens als er een fluorescerend productmolecule gevormd wordt, flakkert het fluorescentielicht op. Met veel geduld en heel wat moleculaire engineering kan men zo een individueel enzymmolecule voor langere tijd in actie zien.
De grote verrassing die uit die studies voortkomt, is dat zo’n enzym niet strikt beantwoordt aan het beeld van de klok. In dit geval zou men een zeer regelmatige opeenvolging van oplichten en uitdoven verwachten. Rekening houdend met het feit dat we echter niet met een macroscopische klok maar met één molecule bezig zijn, verwachten we wel een rommelige (stochastische) spreiding op de heldere en donkere perioden. Dit klopt, maar bovendien blijkt dat het enzym over langere perioden actief en dan weer minder actief is. (Een enzym heeft dus een menselijk trekje: het heeft regelmatig behoefte aan rust). In feite neemt men aan dat het enzym fluctueert tussen meerdere structuren die meer of minder geschikt zijn voor hun taak. Dit suggereert dat er ook ruimte is voor verbetering en daar wordt ijverig naar gezocht.
Een enzym heeft een menselijk trekje: het heeft regelmatig behoefte aan rust
De beste manier om een moleculaire machine in actie te zien is in de studie van de zogenaamde motorproteïnen. Dit zijn eiwitten die chemische energie omzetten in beweging. Een voorbeeld is het eiwit kinesine dat in staat is een subcellulair partikel te transporteren over een microtubule. (Microtubuli zijn holle buisjes die een soort spoorwegnet vormen in de cel). Door het partikel fluorescerend te maken en te koppelen aan kinesine kan men het in de microscoop zien ‘lopen’ over een individuele microtubule. Een ander voorbeeld is de roterende motor van de protonpomp. (De natuur heeft het wiel uitgevonden lang voor de mens). Die motor kan men in actie zien. Men kan de verschillende eiwitten afzonderen en weer samenvoegen tot een werkende motor. Dit kan worden zichtbaar gemaakt door de buitenste moleculen op een plaatje te hechten via een staart (een His-tag) en aan de rotor een fluorescerend staafje te hechten zodat de draaibeweging van de rotor zichtbaar wordt in een fluorescentiemicroscoop. Alhoewel we hier echt een individuele moleculaire motor in actie zien, is de resolutie nog altijd laag (met weinig details). Hoe mooi en verrassend die experimenten ook zijn, ze geven ons nog steeds geen volledig beeld van wat er in het enzym of de motor zelf gebeurt. Om daarover iets te weten te komen zouden we die verschillende structuren zelf moeten kunnen zichtbaar maken.
Laten we dus naar de structuren zelf gaan kijken. De 50.000 gekende eiwitstructuren leren ons wel dat er gemeenschappelijke structuurelementen zijn, maar daarom hebben we ze nog niet aan het werk gezien. Om dat te kunnen doen moeten we naast hun structuur ook hun dynamische eigenschappen bestuderen, namelijk hoe hun structuur verandert in functie van de tijd. De X-stralen- of NMR-structuur is dus duidelijk het startpunt, maar er ontbreekt nog een dynamische component. Dynamica van moleculen begint uiteraard met temperatuur of kinetische energie. Op het absolute nulpunt (0 K) is er geen dynamica. Op 37oC of 310 K is er al veel kinetische energie die de drijfkracht is voor de diffusie van moleculen in oplossing en daardoor moleculen de kans geeft elkaar te ontmoeten. Ook in kristallen zitten de atomen niet stil. De analyse van de kristalstructuren zelf geeft ons reeds een beperkte kijk op de dynamica van de atomen. In tegenstelling tot een echte stilstaande klok die volledig statisch is, zijn de delen van een molecule steeds in beweging, zelfs in een kristal, zelfs als ze ‘niets doen’. Delen die echt flexibel zijn, worden daarom slechts wazig waargenomen. Die flexibiliteit wordt gekenmerkt door de zogenaamde temperatuursfactor, de standaardafwijking van de positie van elk atoom. Zo is al duidelijk te zien welke delen erg star zijn en welke delen meer beweeglijk zijn, zij het dan in het keurslijf van het kristal. Hierin kunnen geen ‘baanbrekende’ structuurveranderingen plaatsgrijpen.
In tegenstelling tot een stilstaande klok die volledig statisch is, zijn de delen van een molecule steeds in beweging, zelfs in een kristal, zelfs als ze ‘niets doen’
Een alternatieve techniek berust op het verschijnsel van Nucleair Magnetische Resonantie (NMR). Die techniek laat toe de structuur te bepalen in oplossing en geeft bovendien een beter beeld van de dynamische eigenschappen. NMR is een techniek waarbij radiogolven worden gebruikt om magnetische dipolen, die zoals kompasnaalden uitgelijnd worden in het magneetveld van het toestel, om te klappen. Dit omklappen gebeurt bij een karakteristieke frequentie, de resonantiefrequentie, die kan worden waargenomen en kenmerkend is voor de aard van de dipool en de sterkte van het veld. Ook de lokale omgeving van naburige dipolen heeft een invloed en veroorzaakt een opschuiven van de resonantiefrequentie, de zogenaamde chemische shift die helpt bij de identificatie. De magnetische naalden waarover het hier gaat, zijn (de spins van) bepaalde atoomkernen en hun natuurlijke aanwezigheid is niet altijd voldoende, zodat er eventueel moeten worden aangereikt. Het omklappen van een spin kan ook een naburige spin beïnvloeden en dit is afhankelijk van de afstand zodat op die manier ook de afstand tussen spins kan worden bepaald. Een NMR-studie van een proteïne geeft dus een enorme verzameling van resonantiefrequenties en interatomaire afstanden.
Een computerprogramma kan nu structuren genereren, en alleen die overhouden die aan de afstandsbeperkingen voldoen en het juiste NMR-spectrum opleveren. Op die manier werd een eerste proteïnestructuur bepaald in 1985 door Kurt Wütrich (Zurich). Nu werden er reeds talrijke eiwitten in oplossing geanalyseerd, uiteraard juist die eiwitten waarvan geen kristallen kunnen worden verkregen. NMR-metingen geven ook duidelijk aan welke delen sterk beweeglijk zijn. De voorwaarde voor de structuurbepaling door NMR is dat het eiwit kleiner is dan zo’n 30.000 Dalton (Da), omdat anders het eiwit te traag rondtolt. Het rondtollen van het eiwit helpt om kleine lokale en tijdelijke verschillen uit te middelen zodat een scherpe resonantiepiek wordt waargenomen. Als het eiwit niet ronddraait, leiden die kleine verschillen tot het vervagen van de resonanties en het verdwijnen ervan in één brede omslag.
Dankzij belangrijke innovaties in de laatste tien jaar werd die bovengrens langzaam opgetrokken (onder andere met de TROSY-techniek, ook een uitvinding van Wütrich, die voor zijn bijdrage in 2002 de Nobelprijs Chemie kreeg). Recent hebben Sprangers en Kay NMR-studies uitgevoerd op het onwaarschijnlijk grote 670.000 Da 20S kernpartikel van het proteasoom en zijn bindingsplaats in het 1.100.000 Da grote proteasoomcomplex. Van die grote constructies wordt echter niet de structuur opgehelderd, maar wordt wel interessante dynamische informatie verkregen. Het proteasoom is een relatief recent ontdekte structuur die instaat voor het verwijderen van oude eiwitten, of die misgevouwen eiwitten meestal voorziet van een ‘afvalsticker’, een ubiquitinelabel. Het is een grote doofpot, een groot vat waarin de geubiquitineerde eiwitten worden opgenomen en verschuiven naar de centrale ruimte waar de afbraak gebeurt, om ten slotte te worden uitgescheiden als kleine peptiden voor hergebruik. Dit is een mooi functionerend cellulair recyclagesysteem voor proteïnen. Spijtig genoeg kunnen ook hier dingen misgaan en een aantal ziektetoestanden hebben daar iets mee te maken. In het geval van het grote proteasoom hebben de nieuwe NMR-technieken aangetoond dat de zijketens aan de ingang van het complex erg mobiel zijn, terwijl die in het binnenste een veel kleinere mobiliteit vertonen. De grote mobiliteit wordt gecorreleerd met het opnemen en de inwendige mobiliteit met het doorschuiven van de eiwitketens bestemd voor afbraak.
Aan alle atomen wordt kinetische energie gegeven en in de computer wordt hun beweging berekend als knikkers die op elkaar botsen
Een volledig gedetailleerd beeld van de dynamische eigenschappen van moleculen wordt uiteindelijk alleen verkregen in computersimulaties, in een rekentechniek die men toepasselijk ‘Moleculaire Dynamica’ (MD) noemt. Aan alle atomen wordt kinetische energie gegeven en in de computer wordt hun beweging berekend als knikkers die op elkaar botsen, te vergelijken met diffunderende moleculen, maar ook rekening houdend met het feit dat ze aan elkaar verbonden zijn door elastische bindingen, dat ze elkaar kunnen aantrekken of afstoten en dat ze in het bad zitten met water en ionen. Het is vanzelfsprekend dat het in de gaten houden van dit grote aantal botsende atomen over langere tijd een enorme hoeveelheid rekenwerk vergt en dat alleen de snelste computers in staat zijn een redelijk groot molecule in atomair detail te volgen over een redelijke tijd. Maar wat is een redelijke tijd? De langste computerberekeningen simuleren enkele nanoseconden, maar het is duidelijk dat grotere tijdschalen nodig zijn.
Dit probleem kan gedeeltelijk worden omzeild door de zogenaamde ‘Doelgerichte Moleculaire Dynamica’. In die techniek wordt een molecule met een extra kracht in de richting geduwd van de nieuwe conformatie. Zo wordt heel wat minder tijd verloren in het berekenen van allerlei uitstapjes van de atomen in richtingen die niet naar het goede doel leiden. De tijdsschaal waarop de processen gebeuren, wordt dan artificieel, maar men kan tenminste zien wat er met de stangen en staven gebeurt. De berekeningen tonen aan dat er vele wegen zijn naar het einddoel, maar dat toch reactiepaden kunnen worden bekomen die in overeenkomst zijn met de metingen in oplossing.
Moleculaire machines in actie zien, zelfs op het niveau van één enkele molecule, is dus mogelijk wanneer men dit interpreteert als het kijken naar de actie zelf. Dit kan zijn het omzetten van een substraat naar een fluorescerend product of het roteren van een fluorescerende staaf, of het verplaatsen van een fluorescerende plastic parel over een microtubule door een kinesinemolecule. Wanneer men echter wil weten wat er in de motor zelf gebeurt, met al zijn onderdelen tot op atomair detail, staan we nog maar aan het begin. We kunnen wel de onderdelen die beweeglijk zijn identificeren, maar het blijft moeilijk te weten welke bewegingen belangrijk zijn en welke niet. Feit is dat moleculaire motoren zich niet gedragen als gewone klokken, waar alleen bewegingen voorkomen die nuttig zijn voor het resultaat (aanduiding van de tijd). Natuurlijke selectie selecteert duidelijk niet noodzakelijk de snelstwerkende motor, maar deze die snel genoeg werkt gezien de omstandigheden en bovendien regelbaar is en dus ruimte heeft om zich aan te passen aan de omstandigheden.
Met ongeveer 50.000 gekende eiwitstructuren is het verbazend dat we nog zo weinig weten over de werking van die machines. We weten dat er meerdere structuren zijn, fluctuaties, alternatieve conformaties met grotere energiebarrières dan de fluctuaties, sommige op weg naar, andere louter zijwegen, geïnduceerde conformaties met nieuwe eigenschappen. We kunnen al zelf eiwitstructuren in beperkte mate ontwerpen, maar om een moleculaire machine te ontwerpen, te bouwen en actief te krijgen, moet er nog veel fundamenteel onderzoek worden verricht en moeten we meer inzichten verwerven in de dynamische eigenschappen van de eiwitten. De nieuwe NMR-technieken zetten alvast een stap in de goede richting.
R. Sprangers en L.E. Kay, ‘Quantitative dynamics and binding studies of the 20S proteasome by NMR’, in: Nature, 2007, 445, 618-622.
A. Velyvis, Y.R. Yang, H.K. Schachman en L.E. Kay, ‘A solution NMR study showing that active site ligands and nucleotides directly perturb the allosteric equilibrium in aspartate transcarbamoylase’, in: Proceedings of the National Academy of Sciences, 2007, 104, 8815-8820.
Yves Engelborghs is als biochemicus verbonden aan de KU Leuven.
This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Unported License