vier muizenklinieken in europa onderzoeken systematisch verschillende muismodellen op hun waarde als model voor diverse menselijke aandoeningen. het doel is om de functie van ieder gen in het genoom te achterhalen en moleculaire mechanismen van menselijke ziekten bloot te leggen. onderzoeksconsortia zoals eucomm en eumodic zetten wereldwijd de toon voor het systematische onderzoek van de gevolgen van gendefecten in genetisch gewijzigde muizen.
Muis in het ziekenhuis
Biomedische onderzoekers, zoals ontwikkelingsbiologen en klinische genetici, ontrafelen vaak de ontstaansmechanismen van menselijke syndromen (ziektebeelden met steeds samen voorkomende klinische symptomen) door diermodellen te bestuderen die gelijkaardige syndromen vertonen. Het meeste fundamentele onderzoek wordt verricht op proefdieren, en niet op de mens. Al meer dan honderd jaar gebruiken onderzoekers genetisch zuivere muizen en mutante lijnen ervan. In genetisch opzicht lijkt de muis meer op de mens dan men op grond van het uiterlijk zou vermoeden: meer dan 95 procent van onze genen zijn vergelijkbaar. Dit maakt de muis tot een zeer goede stand-in voor de mens.
Het gebruik van muizen als modelorganisme voor de studie van menselijke gezondheid en ziekte biedt heel wat voordelen
Het gebruik van muizen als modelorganisme voor de studie van menselijke gezondheid en ziekte biedt heel wat voordelen. Zo zijn de ontwikkeling, groei en anatomie, fysiologie en gedrag sterk gelijkend tussen mens en muis. Ook hebben bijna alle menselijke genen een verwant (ortholoog) gen in de muis, en zijn hun genstructuur, genexpressieregulatie en genoomorganisatie heel gelijkend. Voorts kan het muisgenoom sinds ongeveer dertig jaar relatief eenvoudig, efficiënt én gericht worden gewijzigd, zelfs exclusief in één specifiek weefsel of celtype. Hiervoor gebruikt men stamcellen uit muizenembryo’s. In die stamcellen kan men specifieke genen verwijderen (knock-out) of wijzigen (muteren). Vervolgens kan men met die cellen genetisch gewijzigde muizen maken. In 2007 kregen de pioniers van deze techniek – Mario Capecchi, Martin Evans en Oliver Smithies – de Nobelprijs voor Geneeskunde. Als een gen uitgeschakeld of beschadigd is, dan wordt het eiwit dat door dit gen gecodeerd wordt niet meer aangemaakt of kan het niet meer normaal functioneren. Onderzoekers bestuderen dan de gevolgen van de afwezigheid of de verstoring van dit eiwit in het embryo of in de volwassen muis, in zijn geheel of in specifieke weefsels, en leren veel over de normale functie van het eiwit en zijn mogelijke bijdrage in de ontstaansmechanismen van ziekten.
Een ander voordeel bij het gebruik van muismodellen is dat zeer gestandaardiseerde procedures voorhanden zijn die toelaten het ziektebeeld van muizen systematisch te bestuderen. In het laatste decennium werd dankzij grootschalige internationale samenwerkingsprogramma’s het volledige genoom van verscheidene organismen gedecodeerd, ook dit van de mens in 2003 en van de muis in 2002. Dit leidde tot de identificatie van ongeveer 25.000 genen in mens en muis. Onderzoekers staan nu voor de uitdaging om verder te bouwen op de informatie die verscholen zit in de genoomsequentie. Er moeten functies worden toegekend aan elk van de eiwitten die gecodeerd worden door de geïdentificeerde genen, en ook aan niet-eiwit coderende genen (zoals miRNA-coderende genen), dit alles in de context van een levend dier. Dit noemt men de functionele annotatie van het muisgenoom. De verkregen informatie moet dan in verband worden gebracht met onze kennis over menselijke aangeboren en chronische aandoeningen.
Om die functionele annotatie in de muis systematisch en efficiënt aan te pakken zijn wereldwijd grote initiatieven opgestart, zoals EUCOMM in de Europese Unie, KOMP en TIGM in de Verenigde Staten en NorCOMM in Canada. Die consortia verbinden zich ertoe om gezamenlijk tegen 2020 ieder muisgen te wijzigen of te muteren in embryonale stamcellen, zodat in de meeste gevallen een conditionele uitschakeling van de genfunctie mogelijk is. Vervolgens wil men onderzoeken wat misloopt met de muizen die met die stamcellen kunnen worden gegenereerd in het embryo en het opgroeiende of volwassen dier. Dit moet uiteindelijk leiden tot een encyclopedie van alle genfuncties. Het genereren van al die mutante cellijnen en muizen is een waar huzarenstuk, dat heel efficiënt en gestroomlijnd verloopt dankzij doorgedreven standaardisering in ontwerp en realisatie van de mechanismen (targeting vectoren) waarmee de genen worden gewijzigd en robotisering van selectie, kweek, validatie (en archivering) van de embryonale stamcelculturen. Tegen eind 2011 zouden al achtduizend genen (conditioneel) gemuteerd zijn in embryonale stamcellen van de muis door het EUCOMM-consortium. Het zwaartepunt hiervan ligt in München en Cambridge. Omwille van tijdrovende en financiële redenen wordt niet automatisch van elke stamcel met een gemuteerd gen een mutante muis gemaakt. Dit gebeurt volgens een zorgvuldig bepaalde prioriteitenlijst in het International Knockout Mouse Consortium (IKMC), dat momenteel is uitgebreid met partners in de Verenigde Staten en Canada.
Wat betekent dit nu voor individuele onderzoekers aan onze universiteiten? Tot voor kort vloeide heel wat water naar zee – tussen de beslissing om één geliefkoosd gen te verstoren en het moment waarop de eerste knock-outmuis daadwerkelijk rondliep en men het echte werk, de eigenlijke functionele analyse, kon aanvatten. Het ontwerpen en in elkaar knutselen van de targeting vector is geen sinecure, en het inbrengen van de mutatie in de stamcellen, de karakterisering van deze cellen en het genereren van de muis is een tijdrovend proces dat zelfs voor een geroutineerd laboratorium al snel meer dan een kalenderjaar beslaat. Bovendien zijn er in Vlaanderen slechts een handvol laboratoria die de knock-outtechnologie volledig beheersen. Omdat de reeds genoemde consortia nu de targeting vectoren, gemuteerde stamcelcellen en resulterende muizen ter beschikking stellen aan de wetenschappelijke gemeenschap, is een individuele onderzoeker vaak slechts enkele muiskliks verwijderd van zijn gedroomde mutante cel of muis, en kan hij vrijwel meteen aan de functionele karakterisering van de mutante cel of muis beginnen.
De wetenschappelijke uitdaging ligt niet in het genereren van duizenden gemuteerde stamcellen en muizen, maar in het documenteren en karakteriseren van de defecten ervan
De echte wetenschappelijke én ook praktische uitdaging ligt niet zozeer in het genereren van die duizenden gemuteerde stamcellen en muizen, maar in het documenteren en karakteriseren van de defecten (of fenotypisch karakteriseren) ervan, en het bepalen van de functies van deze genen en hun betrokkenheid in allerlei aandoeningen. De fenotypische karakterisering omhelst onder meer het documenteren van de functionele, morfologische en moleculaire verschillen tussen controlecellen en dieren, en de cellen en dieren met een gewijzigd gen. Ook hiervoor hebben verscheidene instituten de handen in elkaar geslagen. EUMODIC (European Mouse Disease Clinic) is een Europees consortium dat een eerste stap zet in de grootschalige fenotypering van mutante muizen en het bepalen van de rol van de onderzochte genen in ziekteontwikkeling. Het consortium bestaat uit achttien laboratoria in Europa die experts zijn op het gebied van functionele muisgenomica en fenotypering, met reeds vier fenotypeerfaciliteiten of muisklinieken die operationeel zijn in het Verenigd Koninkrijk (MRC Harwell in de Oxfordregio, en Wellcome Trust Sanger Institute in Cambridge), Frankrijk (ICS, Straatsburg) en Duitsland (Helmholtz Zentrum, München).
Dit laatste instituut, waarvan de operationele kost bijkomend gedragen wordt door Duitse overheidsinvesteringen, wordt ook de ‘German Mouse Clinic’ genoemd. Deze muiskliniek opende als eerste haar deuren in 2001 en stond model voor de andere instituten. Omdat de wachtlijsten in de bestaande muisklinieken al zeer lang zijn en de vraag het aanbod ruim dreigt te overschrijden, staan nieuwe muisklinieken in de steigers in Spanje en Italië. Daarnaast gaan verschillende andere initiatieven van start in Canada, Tsjechië en Oostenrijk. Die muisklinieken zijn in feite eerstelijnspolydiagnosecentra voor volwassen muizen. Die worden door twee gescheiden fenotyperingspijplijnen gestuurd volgens een zorgvuldig uitgekiend tijdsschema. Op basis van de resultaten kan dan een verdere karakterisering worden uitgevoerd door specialistische diagnosecentra.
Opdat Europa zijn leidende rol in functionele annotatie van het muisgenoom in de toekomst zou kunnen handhaven en de hiervoor nodige infrastructuur kan bestendigen en verder uitbouwen, hebben leidinggevende instituten en regeringsafgevaardigden uit verschillende landen zich verenigd in InfraFrontier. Dit consortium bespreekt nu al de vereisten en een efficiënte opbouw en verdeling van infrastructuur voor de fenotypering, archivering en verspreiding van muismodellen op een goed gecoördineerd pan-Europees niveau. Het bespreekt eveneens de legale aspecten, de blijvende financiële ondersteuning en kijkt nauwlettend toe op de cruciale uniformisering van standaarden tussen alle partners. Het is uiterst belangrijk dat de resultaten van de ene kliniek gelijk zijn aan de resultaten van een andere kliniek. In een versneld tempo zijn recent ook Oostenrijk, Tsjechië en Canada toegetreden tot InfraFrontier.
België is tot nu toe niet actief vertegenwoordigd in InfraFrontier of in een van bovengenoemde consortia en dreigt de figuurlijke trein die wereldwijd op dreef komt te missen. Hierop anticiperend werd onlangs in het kader van Hercules Type III-financiering groen licht gegeven om in Vlaanderen een platform (InfraMouse) uit te bouwen voor de generatie en archivering van muizen vertrekkend van beschikbare gemuteerde muisstamcellen uit consortia
zoals EUCOMM of het Amerikaanse KOMP. Volwassen en embryonale fenotypering van muizen met defecten in het bloedvatenstelsel en centrale en perifere zenuwstelsel (inclusief darmzenuwstelsel) zijn ook onderdeel van dit InfraMouse-project. De gegevens die gegenereerd worden door de muisklinieken of fenotypeerplatforms berusten net zoals in onze ziekenhuizen op het gebruik van gestandaardiseerde, robuuste methoden, zodat resultaten kunnen worden vergeleken tussen laboratoria en in functie van de tijd. Al de procedures die in het kader van EUMODIC-screenings worden gebruikt, zijn bovendien toegankelijk voor de wetenschappelijke gemeenschap. Ten slotte worden al de ruwe gegevens van de verschillende muisklinieken beheerd door EuroPhenome en vrijgegeven in een ‘open access community’ en intussen geoptimaliseerde databank.
Wat kunnen we ons nu voorstellen bij een muiskliniek? De Duitse muiskliniek biedt zijn ‘patiënten’ een comfortabel verblijf van twee maanden in een kiemvrije omgeving. In die periode ondergaan de dieren een zeer uitgebreide ‘check-up’ die bestaat uit meer dan tweehonderd individuele testen in veertien verschillende klinische domeinen zoals neurologie, immunologie, longfunctie, energiemetabolisme of hart en vaten. Zo kan bijvoorbeeld het exploratiegedrag of het angstgevoel van de muizen worden bepaald door hen met een camera te volgen wanneer ze in een ‘open veld’ worden geplaatst. Andere testen vereisen dan weer gesofisticeerde analyseapparatuur afgestemd op muizenformaat, zoals beeldverwerkingsapparatuur om de hartstructuur en -functie te bepalen, of scanners om verschillende organen en weefsels in verschillende richtingen te visualiseren. Bloedwaarden en bloeddruk worden op regelmatige tijdstippen bepaald. Het onderzoek wordt afgesloten met microscopische weefselanalyses en het in kaart brengen van genexpressiepatronen in verschillende organen. In een dergelijk eerstelijnsonderzoek worden veertig controle (‘wild-type’) en veertig ‘zieke’ (mutante) leeftijdsgenoten onderzocht, gelijk verdeeld over de twee seksen. De onderzoeken verlopen volgens zeer gestandaardiseerde protocollen. Met de uitgebreide hoeveelheid resultaten wordt op het einde van het onderzoek een profiel van de ‘ziekte’ gegeven en wordt een diagnose gesteld. Op basis hiervan kunnen onderzoekers worden geadviseerd om meer specifieke defecten verder in detail te bestuderen via gespecialiseerde onderzoeken (bijvoorbeeld gehoor/doofheid, pijnsensatie of gedrag).
Het uitvoeren en analyseren van dergelijke uitgebreide en gestandaardiseerde fenotyperingsonderzoeken is van een grootteorde die niet is weggelegd voor het gemiddelde individuele onderzoekslaboratorium. De meeste analyses die tot nog toe werden uitgevoerd, waren dan ook klassiek zeer sterk toegespitst op één specifieke vraagstelling, of één orgaan/weefsel of onderzoeksdomein. Dit houdt het risico in dat cruciale defecten in andere organen of systemen over het hoofd gezien kunnen worden. Een belangrijk voordeel van doorgedreven en gestandaardiseerde check-ups van muizen is net dat die rigoureuze onderzoeken een totaalbeeld van de conditie van de ‘patiënt’ aan het licht brengen. Bovendien komen door zo’n zorgvuldige aanpak vaak subtiele – maar klinisch zeer relevante – verschillen aan het licht die voorheen onopgemerkt bleven. Dit komt niet alleen door de zeer gesofisticeerde apparatuur maar ook doordat in de muiskliniek dieren in verschillende condities (rust, stress, infectie, hoog calorisch ‘cafetaria’-dieet, pollutie) onderzocht (kunnen) worden.
Momenteel ligt de nadruk in deze grootschalige projecten sterk op de analyse van muismodellen waarin genen volledig uitgeschakeld worden in het hele organisme (knock-outs) of in specifieke weefsels (conditionele knock-outs). In deze dieren zal het eiwit dat normaal door dit gen gecodeerd wordt, niet meer worden geproduceerd. Men kan echter verwachten dat er een evolutie zal zijn naar het inbrengen van subtielere mutaties geïnspireerd op de (combinaties van) mutaties die bekend zijn bij de mens (microdeleties, kopijaantal variaties et cetera). Dergelijke mutaties leiden doorgaans veeleer tot eiwitten die een verminderde activiteit of afwijkende activiteit hebben ten opzichte van de normale functie van het eiwit.
In deze fase van het onderzoek wordt bijna uitsluitend gewerkt met zuivere muizenstammen (‘inbred’-stammen), wat wil zeggen dat die muizen al meer dan twintig generaties afstammen van een uiterst kleine populatie door inkruisen. Hierdoor staan deze zuivere muizenstammen meer model voor een geïsoleerde bevolking met inteelt zoals op sommige geïsoleerde eilanden. Inteelt kan er enerzijds voor zorgen dat sommige ontwikkelingsdefecten sterker of sneller tot uiting komen, maar anderzijds kunnen deze muizen dan ook minder gevoelig zijn voor andere defecten. In een ideale wereld zou men daarom mutaties het best onderzoeken in verschillende genetische achtergronden, inclusief ‘outbred’-stammen. Op dit moment beperken de muisklinieken zich voor de onderzoeken nog tot volwassen muizen, maar als wetenschappers de ontstaansmechanismen van aangeboren afwijkingen zoals craniofaciale afwijkingen, of hartontwikkelingsstoornissen echt willen ontrafelen, dan zijn onderzoeken die zich toeleggen op ‘prenatale’ analyses van die muismodellen cruciaal. Voor muismodellen met neurodegeneratieve aandoeningen zoals de ziekte van Alzheimer of Parkinson zou een screening op meer gevorderde leeftijd dan weer toepasselijker zijn. Voorts kan worden verwacht dat muisgenen ‘vermenselijkt’ worden, wat wil zeggen dat men een muisgen dat afwijkt van het exemplaar in de mens, vervangt door de menselijke vorm. Zo werd recent aangetoond dat de menselijke vorm van het FOXP2-gen – een gen dat belangrijk is voor taal- en spraakontwikkeling in de mens en slechts minimaal verschilt van dat van de muis (twee aminozuren) – in de muis leidt tot een verandering in de ultrasonische roep, en het exploratiegedrag beïnvloedt. Verder onderzoek bracht specifieke hersenveranderingen aan het licht die nu belangrijk worden geacht in de evolutie van spraak.
De grootschalige multidisciplinaire projecten brengen biomedisch translationeel onderzoek in een stroomversnelling
Transgene muismodellen zijn al decennia zeer waardevol gebleken voor het bestuderen van menselijke ziekten. Het genereren van een transgene muis was tot voor kort erg tijdrovend en duur, maar is ‘slechts’ een noodzakelijke opstap naar het bestuderen van deze muis zelf, en het doorgronden van de onderliggende mechanismen die tot de waargenomen defecten leiden. De recente ontwikkelingen in het veld tonen aan dat het eigenhandig genereren van een transgene muisstamcel en een muis in vele gevallen overbodig is geworden, omdat de betreffende muisstamcel of muis al voorradig is. Bovendien kunnen mutante muizen eens ze in een muiskliniek zijn ingecheckt relatief snel, uitgebreid en gestandaardiseerd worden doorgelicht. Dit betekent een (r)evolutie in de functionele genomica die kan worden vergeleken met de evoluties in de biotechnologie. Pioniers uit de jaren 1970 herinneren zich hoe men eerst gedurende vele maanden ligasen, restrictie-enzymen en andere enzymen diende te zuiveren voordat men de geplande experimenten kon uitvoeren. Later werden al die enzymen commercieel beschikbaar in zuivere vorm, en vandaag worden ze aangekocht in de vorm van kits, waardoor dezelfde experimenten in een fractie van de tijd en erg reproduceerbaar kunnen worden uitgevoerd. Het lijkt er nu sterk op dat de pioniersfase voor het genereren en analyseren van transgene muismodellen ook voorbij is.
Wat eveneens vaststaat, is dat de hier beschreven grootschalige multidisciplinaire projecten biomedisch translationeel onderzoek in een stroomversnelling brengen. Niet alleen zullen de ontwikkelde muismodellen veel onthullen over menselijke ziekten, ze zullen ook een opstap vormen naar de ontwikkeling en validatie van nieuwe en betere behandelingen in de mensenkliniek.
A. Abbott, ‘Mouse genetics: the check-up’, in: Nature, 2009, 460, 947-948.
H. Morgan, T. Beck, A. Blake, H. Gates, N. Adams, G. Debouzy, S. Leblanc, C. Lengger, H. Maier, D. Melvin, H. Meziane, D. Richardson, S. Wells, J. White, J. Wood, M.H. Angelis, S.D. Brown, J.M. Hancock, A.M. Mallon, ‘EuroPhenome: a repository for high-throughput mouse phenotyping data’, in: Nucleic Acids Research, 2010, 38 (Database issue): D577-85.
W. Enard et al., ‘A humanized version of Foxp2 affects cortico-basal ganglia circuits in mice’, in: Cell, 2009, 137, 961-971.
An Zwijsen en Danny Huylebroeck zijn als ontwikkelingsbiologen verbonden aan de KU Leuven en het VIB.
This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Unported License