de laatste decennia worden gekenmerkt door biotechnologische ontwikkelingen die een drastische invloed hebben op ons dagelijks leven. een daarvan is het crispr/cas9-systeem, een biotechnologische tool die de toekomst van de geneeskunde en tal van andere domeinen kan veranderen. om het potentieel en de mogelijke risico’s van deze techniek in te schatten is het belangrijk om beter te begrijpen welke biologische basisprincipes erachter schuilgaan. enkel op die manier kan een maatschappelijk draagvlak ontstaan dat nodig is om uitdagingen zoals de bestrijding van infectieziekten aan te pakken.

DNA-chirurgie: het CRISPR/Cas9-systeem als moleculair scalpel

Rob Lavigne

De laatste jaren is er heel wat controverse ontstaan over ‘CRISPR/Cas9-gebaseerde genoomengineering’. Deze biotechnologische techniek stelt wetenschappers in staat om de genetische code van verschillende organismen op een zeer precieze manier te wijzigen, zowel bij micro-organismen als bij planten of dieren. Dankzij deze methode kunnen bijvoorbeeld gewassen aangepast worden zodat ze beter bestand zijn tegen droogte. Zo kan men aan de stijgende nood aan voedsel tegemoetkomen in deze tijden van klimaatverandering en toenemende wereldbevolking.

Dit alles roept natuurlijk heel wat ethische vragen op. Is dit wel de juiste manier om onze voedselproblematiek aan te pakken? Welke zijn de gevaren en misbruiken die met deze methode gepaard kunnen gaan? De CRISPR/Cas9-editingtechniek kan immers ook toegepast worden bij de mens. Zo zouden genetische ziekten gecorrigeerd kunnen worden of kan het menselijke immuunsysteem aangepast worden om kanker te bestrijden. In 2018 zorgde de Chinese wetenschapper Dr. He Jiankui voor een donderslag bij heldere hemel door aan te kondigen dat hij de eerste ‘CRISPR-baby’s’ ter wereld had gebracht. Zijn team wijzigde het DNA van embryo’s om een gen te corrigeren dat aanleiding geeft tot mucoviscidose (taaislijmziekte). Dit gebeurde echter op een onzorgvuldige en onbesuisde manier, waardoor er wereldwijd fel protest kwam door andere wetenschappers in het veld, onder meer door Jennifer Doudna, de kersverse Nobelprijswinnaar voor chemie. Dit protest heeft geleid tot het ontslag van He Jiankui en tot een wereldwijd moratorium op het menselijk klinisch gebruik van dit soort DNA-editing. Een breed maatschappelijk debat en draagvlak zal zich moeten ontwikkelen vooraleer hier verandering in komt en een duidelijke reglementering kan worden uitgebouwd. Daartoe is een grondige kennis van de biologische basisprincipes van deze nieuwe techniek erg belangrijk.

Men kan de techniek vergelijken met een chirurgisch scalpel dat geen littekens nalaat tijdens de ‘operatie’

CRISPR/Cas9 is momenteel de meest efficiënte en goedkoopste manier om DNA-editing te bewerkstelligen in levende organismen. Men kan de techniek vergelijken met het scalpel van een chirurg, maar dan een nieuw type scalpel dat geen littekens nalaat tijdens de ‘operatie’. Met andere woorden: CRISPR/Cas9 knipt het DNA op de specifieke plaats die gewijzigd moet worden. Het DNA wordt vervolgens gerepareerd zonder sporen achter te laten. Aan de ene kant is dat een enorm voordeel, omdat wijzigingen worden gemaakt zonder ongewenste bijkomende veranderingen. Maar aan de andere kant wordt het bijna onmogelijk om eventuele wijzigingen achteraf nog te identificeren of te controleren.

Wanneer we de veiligheid van CRISPR/Cas9-genoomediting willen nagaan, is het belangrijk om deze techniek te vergelijken met andere methodes die momenteel beschikbaar zijn. Sinds duizenden jaren heeft de mensheid immers dieren en planten gekweekt en genetisch gekruist. Op die manier kregen we bijvoorbeeld grotere en sappigere appels of koeien die meer melk produceren. Nobelprijswinnaar voor de vrede Norman Borlaug kreeg deze eer in 1970 door gewassen zoals tarwe en rijst te verbeteren. Door zijn onderzoek konden miljoenen (zo niet miljarden) mensen gevoed worden, waardoor hongersnood op wereldschaal werd ingedijkt (de zogenaamde ‘Groene Revolutie’). Gelijkaardige genetische kruisprogramma’s bij runderen leidden tot zogenaamde dikbilrunderen die een hoog slachtrendement hebben. Maar deze moederdieren kunnen niet meer op een natuurlijke manier bevallen door hun extreme spierontwikkeling, hetgeen op zijn zachtst gesteld vragen oproept omtrent dierenwelzijn. Daarnaast verlopen deze traditionele manieren van kruisen zeer traag en is een positief resultaat moeilijk te voorspellen.

De mensheid heeft al duizenden jaren dieren en planten gekweekt en genetisch gekruist

Om het proces van DNA-wijzigingen te versnellen, werden planten blootgesteld aan gammastraling of aan chemicaliën die veranderingen in het genetisch materiaal induceren. Dit concept, dat ‘mutation breeding’ wordt genoemd, vindt veel toepassingen maar is eigenlijk slordig, niet-specifiek en inefficiënt omdat de geïnduceerde mutaties toevalsgewijs plaatsvinden. Op dat vlak staat mutation breeding mijlenver van de ‘scalpelprecisie’ die men met CRISPR/Cas9 kan bekomen. Echter, de geselecteerde mutanten die uit mutation breeding voortkomen en toevallig de gewenste eigenschappen hebben, worden niet beschouwd als genetisch gemodificeerde organismen, omdat de mutaties op natuurlijke wijze plaatsvonden (in zoverre dat men het gebruik van radioactieve bestraling als natuurlijk kan bestempelen).

In de jaren ‘80 en ‘90 van de vorige eeuw deed de biotechnologie haar intrede, met de eerste moleculaire tools (enzymen die wijzigingen kunnen aanbrengen in het genetisch materiaal). Een voorbeeld is het Cre/lox systeem, dat op een gerichte manier wijzigingen kan aanbrengen in het genoom. Deze techniek laat echter kleine ‘littekens’ achter in de vorm van een stukje ongewenst DNA. Vanuit een voorzorgsprincipe is de aanwezigheid van dit extra DNA uiteraard niet optimaal. Andere enzymgebaseerde systemen zoals ‘Zinc-finger nucleases’ en ‘TALENs’ waren op dat vlak een verbetering en zijn breder inzetbaar. Maar ook deze technieken zijn technisch complexer wanneer we ze vergelijken met CRISPR/Cas9-gebaseerde DNA-editing.

Uit het voorgaande blijkt dat een betere integratie nodig is van de huidige Europese wetgeving voor al deze technieken. Deze wetgeving legt het gebruik van CRISPR/Cas9-editing aan banden, terwijl andere soortgelijke, of zelfs meer ingrijpende, technieken wel worden toegestaan. Ook naar de toekomst toe kunnen we verwachten dat er nog andere, superieure technieken ontdekt zullen worden, die op hun beurt weer een ethisch en wetgevend kader zullen vereisen.

De huidige Europese wetgeving legt het gebruik van CRISPR/Cas9 aan banden, terwijl andere, soms meer ingrijpende, technieken wel worden toegestaan

Om de ontwikkeling van deze nieuwe technologie te begrijpen is het interessant om de vraag te stellen waar het CRISPR/Cas9-systeem vandaan komt. Hoe werd het ontdekt? Daarvoor moeten we terug naar de jaren 1980. Toen werd in het genetisch materiaal van bepaalde bacteriën een DNA-sequentie teruggevonden met eigenaardige eigenschappen: stukjes uniek DNA die als wagonnetjes aan mekaar waren gekoppeld door eenzelfde type ‘DNA-koppelstuk’. Op basis hiervan kreeg CRISPR zijn uiteindelijke naam: ‘Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats’. Dit is een gebied in het DNA van de bacterie waar kleine, unieke stukjes DNA (zogenaamde ‘spacers’) zijn onderbroken door een palindromisch herhaalde sequentie die als ‘koppelstuk’ werkt. Deze unieke stukjes DNA zijn onder meer afkomstig van virussen. Net zoals de mens vatbaar is voor virussen zoals SARS-CoV-2, het griepvirus of het hiv-virus, bestaan er ook virussen die eencellige bacteriën afdoden. Deze bacteriële virussen worden ‘bacteriofagen’ (uit het Grieks ‘bacterie-eters’) genoemd en vormen een enorme bedreiging voor alle bacteriën. Er wordt geschat dat elke dag tot de helft van alle bacteriën worden afgedood door deze bacteriofagen, en dit al miljarden jaren.

Verder onderzoek wees uit dat het CRISPR/Cas9-systeem eigenlijk een immuunsysteem van de bacterie is. Dit systeem heeft zich tijdens de co-evolutie met bacteriofagen ontwikkeld om de bacterie te beschermen tegen zijn natuurlijke vijanden. Een bacteriofaag injecteert zijn viraal DNA in de bacteriecel, om deze over te nemen en de cel om te vormen tot een faagproducerende machine. Het CRISPR/Cas9-systeem steekt hier een stokje voor. Wanneer de DNA-code van de aanvallende faag overeenkomt met een stukje DNA uit het ‘treinwagonnetje’ in de CRISPR-regio van daarnet, zal het vreemde faag-DNA kapotgeknipt worden, dankzij het Cas9-enzyme uit het CRISPR/Cas9-systeem. Hoe meer verschillende wagonnetjes de bacterie heeft, hoe beter de cel zich kan verdedigen tegen verschillende aanvallen van vreemd faagvirus-DNA. Het is dus de combinatie van de specifieke CRISPR-sequentie die het Cas9-enzym ‘begeleidt’ zodat het DNA op de juiste plek wordt geknipt. Op die manier hebben Nobelprijswinnaars Doudna en Charpentier dit natuurlijke biologische beschermsysteem van de bacterie aangepast voor de biotechnologische toepassingen. Men kan immers eender welk wagonnetje (of eender welke DNA-sequentie) koppelen aan het Cas9-knipenzym en zo op een gerichte manier wijzigingen aanbrengen.

Het onderzoek aan het Leuvense Laboratorium voor Gentechnologie focust zich op de interactie tussen bacteriën en bacteriofagen. Het is voornamelijk op zoek naar nieuwe manieren om schadelijke, ziekteverwekkende bacteriën te bestrijden. Bacteriofagen, de ultieme killers van bacteriën, vormen hierbij de inspiratiebron. Het is immers van enorm belang dat er alternatieven worden gezocht voor traditionele antibiotica, aangezien infecties door antibioticumresistente superbacteriën één van de belangrijkste uitdagingen van de 21ste eeuw vormen. Een bacteriofaag herkent en infecteert de bacteriecel en zal nieuwe bacteriofaagpartikels vormen en de bacterie afdoden. De nieuwgevormde faagpartikels zullen op hun beurt andere bacteriecellen aanvallen. Zo vormen de bacteriofagen in feite zichzelf vermenigvuldigende antibacteriële middelen, die op een totaal andere manier werken dan antibiotica, die als kleine moleculen bijna letterlijk een stok in de wielen van het bacteriële metabolisme steken. Het medische gebruik van bacteriofagen wordt faagtherapie genoemd en wordt in België sinds een aantal jaren toegepast op een handvol patiënten met zeer ernstige bacteriële infecties.

Bacteriofagen zijn in feite zichzelf vermenigvuldigende antibacteriële middelen

Maar wat dan met het CRISPR/Cas9-immuunsysteem van de bacterie? Ongeveer de helft van alle gekende bacteriën beschikken over CRISPR/Cas9 of één van de zes soortgelijke immuunsystemen.  De aanwezigheid van het CRISPR/Cas9-systeem vormt dus inderdaad één van de bepalende factoren voor het succes of falen van bacteriofagen. Zo komen bacteriën en bacteriofagen in een echte wapenwedloop: de evolutie die heeft geleid tot de ontwikkeling van het CRISPR/Cas9-systeem in bacteriën heeft er ook voor gezorgd dat bacteriofagen beschermingsmechanismen ontwikkelden tegen dit systeem. Bacteriofaag-gecodeerde ‘anti-CRISPR’-eiwitten blokkeren de werking van het CRISPR/Cas9-systeem, terwijl nog andere bacteriofagen in staat zijn hun DNA chemisch om te bouwen zodat het Cas9-eiwit niet langer het vreemde DNA herkent en knipt. Deze evolutiegedreven wapenwedloop vormt de sterkte van faagtherapie, maar werkt alleen wanneer de bacteriële infectie precies gekend is, zoals bij chronische infecties. Door de enorme vooruitgang in genoomsequentieanalyse zijn we nu in staat om de volledige DNA-sequentie van pathogene bacteriën van individuele patiënten in kaart te brengen en deze te ‘matchen’ met de beste bacteriofaagcocktail. De bacteriofagen zijn immers zeer specifiek in hun capaciteit om bepaalde bacteriestammen af te doden, en het CRISPR/Cas9-systeem is hierbij één van de factoren. De toekomst zal uitwijzen in welke mate faagtherapie een alternatief kan zijn voor traditionele antibioticabehandeling, maar het is duidelijk dat een grondige kennis van zowel bacterie als bacteriofaag van cruciaal belang zal zijn.

De kennis omtrent de interactie tussen bacteriofagen en bacteriën leidde niet alleen tot het CRISPR/Cas9-systeem, maar ook tot tal van biotechnologische tools die sedert decennia in laboratoria worden gebruikt. Vanuit biotechnologisch standpunt kan men een bacteriofaag beschouwen als een ‘moleculaire injectienaald’, die genetisch materiaal in de bacteriecel inspuit. Deze eigenschap inspireerde een aantal biotechnologische bedrijven om een ‘Paard van Troje’-strategie te ontwikkelen in de bestrijding van bacteriën. Het Deense bedrijf SNIPR BIOME en het Franse ELIGO Bioscience ontwikkelden hiervoor een gelijkaardige strategie: ze gebruiken bacteriofaagpartikels als een nanonaald om een zelfgecodeerd CRISPR/Cas9-systeem in de bacteriecel te injecteren. Dit CRISPR/Cas9-systeem is echter zo aangepast dat het bacteriële DNA stuk wordt geknipt. Met andere woorden: de wetenschappers ontwikkelden zelf het treinwagonnetje dat het DNA-doelwit bepaalt. Op die manier keert het CRISPR/Cas9-systeem zich tegen de ziekteverwekkende bacterie, en kan het zo geprogrammeerd worden dat deze bacteriën afsterven, of dat hun antibioticumresistentiegenen worden vernietigd. Door deze specifieke werking blijven goedaardige bacteriën onaangetast, hetgeen belangrijk is voor een moderne duurzame antibacteriële strategie.

Goedaardige bacteriën blijven onaangetast

Uit dit alles kunnen we een aantal belangrijke conclusies trekken. De impact van biotechnologie is immens en heeft het potentieel om verschillende domeinen te transformeren, waaronder de geneeskunde en voedselproductie. Het CRISPR/Cas9-editingsysteem vormt hierin één belangrijke schakel waarvan de volledige impact zich nog verder moet ontwikkelen. Gezien de creativiteit en het inzicht van zowel academische als industriële onderzoekers staat de volgende generatie van ontwikkelingen ongetwijfeld voor de deur. Hierbij is het belangrijk dat de opkomst van dit soort technologieën hand in hand gaat met een grondig maatschappelijk en ethisch debat. Gezien de exponentiële groei van wetenschappelijke kennis rond ‘moleculaire scalpels’ of ‘nano-injectienaalden’ is het niet eenvoudig om veel van deze – relatief abstracte – begrippen te vertalen in deze belangrijke discussie. Dit vereist een grondige kennisgedreven opinievorming die vaak haaks staat op de trends op hedendaagse socialemediafora, beïnvloed door diverse belangengroepen. Toch zullen deze ontwikkelingen van cruciaal belang zijn om de uitdagingen van de toekomst tegemoet te treden.

Rob Lavigne is professor, onderzoeker en hoofd van het Laboratorium voor Gentechnologie binnen het Departement Biosystemen (Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen) van de KU Leuven. Hij is houder van een ‘ERC consolidator grant’ omtrent de biotechnologische toepassing van bacteriofagen.