horen, zien en voelen laten ons toe de wereld om ons heen te ontdekken. maar soms schieten onze zintuigen te kort: vele objecten zijn gewoon te klein of te ver van ons verwijderd om ze zonder hulpmiddelen waar te nemen. het onderzoek naar materialen heeft zich de laatste decennia toegespitst op de bestudering van het superkleine en heeft heel wat nieuwe microscopietechnieken ontwikkeld. die vertonen verrassend veel gelijkenissen met hoe onze zintuigen werken.

Observeren en meten op nanoschaal

Steven de Feyter

Om de wereld om ons heen te verkennen maken we gebruik van onze zintuigen. Horen, zien en voelen laten ons toe om de omgeving in ons op te nemen en zo onze weg te vinden. Maar in een aantal gevallen schieten onze zintuigen te kort: vele objecten zijn immers te klein of te ver van ons verwijderd. We hebben dan ook steeds fijnere hulpmiddelen en gereedschap ontwikkeld om inzicht te verwerven in de structuur van het supergrote (zoals het zonnestelsel, het heelal) en het superkleine (zoals atomen, elektronen). Ook het onderzoek naar materialen heeft zich toegespitst op de bestudering van het ultrakleine. De laatste decennia zijn er heel wat nieuwe analysetechnieken ontwikkeld. Een duidelijke trend binnen die ontwikkeling is de toename van hun gevoeligheid en resolutie. De lengteschaal of resolutie die de verschillende analysetechnieken bereiken om structurele informatie op te leveren, bevindt zich tegenwoordig in het micrometergebied (0,000001 m) of het nanometergebied (0,000000001 m). De nanometer is de relevante lengtemaat in de nanowetenschappen en de nanotechnologie. Een aantal van die voornamelijk nieuwe microscopietechnieken vertoont sterke gelijkenissen met onze zintuigen: materialen worden gekarakteriseerd, niet alleen door ze te zien, maar ook door ze te horen en te voelen. In dit stuk willen we de gelijkenis belichten tussen de moderne microscopie en onze zintuigen.

Materialen worden gekarakteriseerd, niet alleen door ze te zien, maar ook door ze te horen en te voelen

Met een optische microscoop of lichtmicroscoop worden kleine objecten uitvergroot via zichtbaar licht en lenzen. Optische microscopie is heel populair omdat zo heel kleine objecten met onze ogen kunnen worden waargenomen. De ogen beschikken immers niet over het ‘oplossende’ vermogen om een goed beeld te krijgen van heel kleine objecten. Inzicht in de principes van de optica liet echter toe om apparaten te bouwen die als het ware de materie uitvergroten. In de zeventiende eeuw ontwikkelde Antoni van Leeuwenhoek reeds optische microscopen waarmee hij als eerste ééncellige organismen kon waarnemen en beschrijven. Zijn succes bestond erin dat hij een nieuwe en eenvoudige manier gevonden had om kwaliteitsvolle lenzen te maken. Hij was een geslepen zakenman, die zijn omgeving in de waan liet dat dit succes het resultaat was van hard werk en het slijpen van steeds kleinere lenzen. Door opeenvolgende technische verbeteringen werd het mogelijk om objecten met een steeds betere resolutie in beeld te brengen: de beelden werden ‘scherper’ en altijd maar kleinere details konden worden gevisualiseerd. De optische microscopie stuitte echter op een grens die niet kon worden doorbroken door gewoon de kwaliteit van de optische componenten te verbeteren. De resolutie hangt namelijk ook af van de kleur van het licht dat op het object invalt.

Het voor onze ogen zichtbare spectrum van het zonlicht is opgebouwd uit verschillende kleuren – regenbogen zijn een duidelijk voorbeeld hiervan. Licht kan worden beschreven als een elektromagnetische straling: met elke kleur komt een bepaalde golflengte overeen. Onze ogen zijn ruwweg gevoelig voor elektromagnetische straling tussen de 400 nanometer (nm) (die overeenkomt met violet) en de 750 nm (die overeenkomt met rood). Hoe korter de golflengte van het licht dat ingestuurd wordt op een object, hoe beter de resolutie is. Dit is het gevolg van de diffractielimiet, waardoor de resolutie ongeveer de helft bedraagt van de gebruikte golflengte. Met violet licht kun je dus kleinere details onderscheiden dan met rood licht. Maar als de afstand tussen twee objecten kleiner is dan ongeveer 250 nm, valt het niet mee om ze als individuele objecten van elkaar te onderscheiden.

Hiermee zijn we echter nog steeds ver verwijderd van de afmetingen van individuele moleculen of atomen. Kleinere types van moleculen zijn immers niet groter dan één nanometer. Dit betekent niet dat het met optische microscopen onmogelijk is om individuele moleculen te detecteren en van elkaar te onderscheiden. Sommige moleculen zenden bijvoorbeeld zichtbaar licht uit (fluorescentie). Als de afstand tussen die moleculen groot genoeg is, dan worden ze zichtbaar als vormeloze of schijfvormige vlekjes, waarvan de diameter tientallen tot honderden keren groter is dan hun werkelijke afmetingen. Je kunt die moleculen dus wel als individuele objecten van elkaar onderscheiden met fluorescentiemicroscopie, maar alleen als ze ver genoeg van elkaar verwijderd zijn. Je kunt dit vergelijken met sterren aan het hemelfirmament: een lichtvlekje is niet noodzakelijk afkomstig van één ster.

Je kunt moleculen als individuele objecten van elkaar onderscheiden met fluorescentiemicroscopie, maar alleen als ze ver genoeg van elkaar verwijderd zijn

Door de beperkingen in resolutie van optische microscopie werden in de vorige eeuw nieuwe technieken ontwikkeld die werken op basis van straling van een veel kortere golflengte, zoals bijvoorbeeld X-stralen. De golflengte van ‘zachte’ X-stralen bedraagt ongeveer 3 nm en die van ‘harde’ X-stralen 0.1 nm. Nog andere microscopietechnieken zijn gebaseerd op het afvuren van elektronen. Elektronen kunnen enerzijds worden beschouwd als minuscuul kleine negatief geladen partikeltjes. Anderzijds kunnen ze ook worden beschreven op basis van hun golfkarakter. Zo laat de huidige generatie elektronenmicroscopen toe om individuele atomen in kleine clusters te visualiseren. De golflengte van elektronen in bijvoorbeeld een 200 kV transmissie-elektronenmicroscoop bedraagt slechts 2,5 picometer. Eén picometer is een duizendste van een nanometer.

Ondanks de beperkingen die het gevolg zijn van de diffractielimiet werd heel recent een aantal nieuwe optische microscopietechnieken ontwikkeld op basis van zichtbaar licht die een betere resolutie halen (tot tienmaal beter) dan wat op basis van de diffractielimiet mag worden verwacht. Een aantal van die technieken is gebaseerd op het uitsturen van licht door moleculen (fluorescentie) wanneer ze geactiveerd worden door een andere lichtbron (bijvoorbeeld door een laser). Stel bijvoorbeeld dat je een object hebt dat honderden lichtuitstralende moleculen bevat die heel dicht bij elkaar zitten. Dit kan bijvoorbeeld een organel van een cel zijn. Als die moleculen allemaal tegelijkertijd licht uitstralen, dan zal dat object zichtbaar zijn zonder fijnstructuur. Als je er nu kunt voor zorgen dat tegelijkertijd slechts een willekeurige kleine fractie van die moleculen licht uitzendt, dan zal je een beeld krijgen van kleine schijfjes. Bij een volgend beeld zal een andere willekeurige fractie van moleculen oplichten. Bij nog een ander beeld zal nog eens een andere willekeurige fractie van moleculen oplichten, en zo verder. Via software kan dan het midden van elk individueel lichtschijfje worden bepaald. Door al die beelden op te tellen waarbij slechts het midden van elk lichtschijfje aangegeven is, krijg je een veel betere resolutie. De ontwikkeling van die optische microscopen met superresolutie is van zeer groot belang in het materiaalonderzoek en voor biologische en biomedische toepassingen.

Naast de traditionele visuele technieken en afgeleiden zijn er ook technieken die meer gebaseerd zijn op ‘horen’ dan op ‘zien’. In materiaalonderzoek bijvoorbeeld wordt ‘geluid’ gebruikt, onder meer via akoestische microscopie, om de micro- en nanostructuur van specimens te onderzoeken. Akoestische microscopie is gebaseerd op het ‘afvuren’ van geluidsgolven op het materiaal. Je kunt dit vergelijken met een ‘sonar’, maar dan met een veel betere resolutie. Net zoals bij lichtgolven kunnen geluidsgolven door het materiaal worden geabsorbeerd, gereflecteerd of verstrooid. Het menselijke oor is niet gevoelig voor die geluidsgolven, maar het gereflecteerde geluid (de echo) kan wel worden gedetecteerd door het geluidsgevoelige element in de microscoop. Die techniek laat onder meer toe om breukvlakken in materialen te detecteren, onder het oppervlak. Ook composietmaterialen, die opgebouwd zijn uit verschillende componenten, zijn uitermate geschikt om met die microscopietechniek bestudeerd te worden. Maar zoals voor andere microscopietechnieken wordt de resolutie onder meer bepaald door de golflengte. Voor routinetoepassingen bedraagt de resolutie ongeveer één micrometer.

Net zoals bij lichtgolven kunnen geluidsgolven door het materiaal worden geabsorbeerd, gereflecteerd of verstrooid

Niet alleen visuele of auditieve prikkels geven informatie over de wereld om ons heen. Ook door objecten aan te raken vormen we een beeld van de omgeving. Zijn die objecten ruw of glad, hard of zacht? Net zoals een slechtziende een stok gebruikt, zo zijn er ook microscopietechnieken ontwikkeld die uitermate geschikt zijn om met een heel goede resolutie oppervlakken af te tasten. Optische technieken zijn immers vaak niet bruikbaar om informatie te bekomen over het reliëf van oppervlakken of andere oppervlakte-eigenschappen.

‘Scanning probe’-microscopen werden een paar decennia geleden ontwikkeld. Een gemeenschappelijk kenmerk van deze familie van niet-optische microscopen is dat ze beschikken over een ‘probe’ of een tip die heel nauwkeurig over een oppervlak kan worden bewogen. De meest populaire techniek is atoomkrachtmicroscopie (in het Engels afgekort als AFM). De ‘probe’ is een scherpe tip die aan het uiteinde van een bladveertje is bevestigd. Wanneer twee objecten heel dicht bij elkaar worden gebracht, dan oefenen ze een kracht uit op elkaar: aanvankelijk worden ze tot elkaar aangetrokken, maar als de afstand heel klein wordt, stoten ze elkaar af. Daardoor buigt het bladveertje waarop de scherpe tip bevestigd is in de ene of andere richting door. De mate waarin het bladveertje doorbuigt, wordt optisch gedetecteerd en staat in relatie met de kracht die de tip en het oppervlak op elkaar uitoefenen. Via uiterst gevoelige apparatuur kan de tip over het oppervlak worden bewogen. In eerste instantie leidt het afscannen van een oppervlak volgens een vast patroon (raster) tot een gedetailleerd beeld van het reliëf of topografie van het oppervlak. Hierbij kunnen hoogtevariaties kleiner dan de diameter van een atoom worden gedetecteerd. Maar dit is niet alles: ook de elastische eigenschappen van de gescande oppervlakken kunnen met nanometerresolutie in beeld worden gebracht.

Naast atoomkrachtmicroscopie is ‘scanning tunneling’-microscopie (STM) een andere populaire niet-optische techniek. Ook bij die techniek wordt het oppervlak gescand door een ‘probe’, in dit geval een aangescherpte tip uit metaal. In tegenstelling tot atoomkrachtmicroscopie wordt in dit geval geen kracht maar wel een tunnelstroom gedetecteerd. De tunnelstroom is een kwantummechanisch fenomeen waarbij elektronen doorheen een barrière ‘tunnelen’ na het aanleggen van een spanning tussen de tip en het staal. Het grote verschil met een klassieke ‘stroom’ is dat de tunnelstroom exponentieel afneemt met de afstand tussen de twee geleiders (tip en staal). Op basis van die extreme afstandsgevoeligheid kan een heel goede resolutie worden gehaald. Met deze techniek is het zelfs mogelijk om routinematig individuele atomen en moleculen te visualiseren. De resolutie is dus fenomenaal. Een nadeel is wel dat deze techniek slechts toepasbaar is op geleidende oppervlakken.

Naast de basisprincipes van zien, horen en voelen zijn er tegenwoordig ook microscopietechnieken die de verschillende mechanismen combineren. Zo zijn er technieken die ‘voelen’ combineren met ‘zien’. De ‘scanning probe’-microscopen geven in eerste benadering informatie over de topografie of het reliëf van een oppervlak. Met lichtmicroscopie daarentegen kunnen verschillende objecten aan een oppervlak, of dieper in een transparant materiaal, van elkaar worden onderscheiden op basis van verschillen in kleurgevoeligheid. Door nu beide technieken met elkaar te combineren kan meer en complementaire informatie worden verkregen. Een probleem hierbij is dat de resolutie van traditionele optische microscopen slechter is dan die van ‘scanning probe’-microscopen. Het is echter mogelijk om de diffractielimiet te omzeilen en dus de optische resolutie beter te maken, door het licht te sturen door een opening waarvan de diameter vele malen kleiner is dan de golflengte van het gebruikte licht. De diameter van die lichtvlek is echter slechts klein aan de opening zelf. Het is dan ook de kunst om die lichtvlek met een diameter van bijvoorbeeld 50 nm heel dicht tot bij het staal te brengen. Dit wordt mogelijk door de combinatie met atoomkrachtmicroscopie, waarbij een holle tip gebruikt wordt met een heel kleine opening. Zo kan men een oppervlak aftasten en met heel hoge resolutie zowel topografische als optische informatie verkrijgen: die techniek noemt men nabije-veld optische microscopie.

Daarnaast zijn er ook technieken die ‘voelen’ combineren met ‘horen’. Voor optische microscopie is het nog mogelijk om met nieuwe ontwikkelingen de diffractielimiet te omzeilen. Voor akoestische microscopie is dit een stuk moeilijker. Om de golflengte van de geluidsgolven te verlagen moet immers de ultrasone frequentie worden verhoogd. Dat leidt echter om tal van praktische redenen tot een drastische verlaging van de gevoeligheid. Maar door combinatie met opnieuw de ‘scanning probe’- microscopie komt de nanometerschaalresolutie ook hier binnen bereik en kunnen elastische en visco-elastische eigenschappen worden gedetecteerd, met een veel betere resolutie dan men ooit voor mogelijk hield.

Materiaalonderzoek is in volle beweging, en vaak is de ontwikkeling van nieuwe analysetechnieken de bepalende factor om tot nieuwe inzichten te komen. Resolutie en gevoeligheid spelen hierbij een belangrijke rol, maar dat is natuurlijk niet alles. Het simultaan verkrijgen en verwerken van verschillende signalen maakt ook een betere analyse mogelijk en verschaft nieuwe inzichten. Net zoals wij het best van onze omgeving kunnen genieten door niet alleen te voelen, te luisteren of te kijken, maar door al die indrukken samen te bundelen.

Andrew Briggs en Oleg Kolosov, Acoustic Microscopy. (Oxford: Oxford University Press Inc., 2009).

Steven de Feyter is als chemicus verbonden aan de KU Leuven.